ChIP-Seq样品

      ChIP 测序(ChIP-ed测序) DNA样品要求

　　样品准备

　　建议打断后DNA电泳主带在100-500bp范围内，主峰在200-300bp，最佳长度在250bp左右。请提供胶图；为确认样品的片段大小，请标明对应的marker 大小。

　　样品总量：≥ 20 ng（满足两次及两次以上建库，单次建库10 ng）

　　详细填写样品信息单

　　送样建议

　　对于ChIP 获得   DNA设计引物进行 Q-PCR 验证和定量，请提供检测位点的检测报告，附阳性和阴性对照。

　　样品纯度：OD260/280值应在1.8～2.0 之间。

　　样品进行检测时最少需要消耗 1-2μ1样品，建议样品体积大于10μl。

　　注意：乙方将采QUBIT对DNA样品进行检测，最终DNA量以乙方的检测结果为准。

　　运输要求

　　样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管中，再将50 ml管放在封口袋中。

　　为了防止低浓度样品黏附在离心管壁上，请使用non-stick tube运输DNA。

　　建议使用干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。如果干冰运输，时间不要超过72小时，如果利用冰袋运输，则时间最好不要超过24小时。

　　将填写的ChIP测序样品信息表格随样品一起运送。

      ChIP测序建库须知

　　样品总量低于10ng：样品总量低于5ng建库风险很大；对于5-10ng的样品可以尝试建库，但存在一定程度的测序风险，如果DNA片段大小完全符合送样要求（100～500bp），且纯度较好，其风险相对较低。另样品总量低于15ng，所有样品都将用于建库，无备份。

　　关于Q-PCR验证

　　建议在完成ChIP实验后，选择某一已知的阳性DNA结合区域设计Q-PCR实验，由此验证ChIP实验的可靠性。但此建议不适合于没有阳性对照序列的ChIP实验。

　　关于提供超声打断胶图

       ChIP-ed DNA样品，将进行Qubit-HS检测以确定其总量，并不采用常规电泳检测确认其片段大小，以及是否存在蛋白污染，同时要参考超声打断的胶图，以便判断DNA片段大小是否符合建库要求。

　　超声打算胶图和实际片段大小不符，导致建库不成功。ChIP实验中，即使超声打断后电泳结果显示DNA片段大小符合100～500bp的要求，抗体富集后的DNA片段大小情况却仍然有可能与之存在一定的差异。极个别情况下（偏小（小于100bp）或偏大（大于500bp））会导致建库失败。从而出现检测样品总量符合要求，却建库不成功的现象。

       ChIP-ed DNA样品中含有其他物种DNA污染，导致测序数据质量不好。ChIP实验过程中，极偶然的情况下会存在外源物种DNA明显污染样品的情况（如：使用鲑鱼精DNA封闭beads；建议使用不需进行封闭的beads），如果建库完成后未进行TA克隆检测，那么这种情况只有在测序完成后，进行分析比对时才会被发现。因此建议在进行ChIP实验时，对整个实验过程进行严格控制，以降低这种风险。

　　样品明显污染情况

       ChIP 样品中如含有明显的蛋白质或离子浓度过高或其它杂质污染，可能会使 2100检测峰图异常，对建库过程中的酶反应产生影响，导致建库失败。

　　送样总量低于10ng，对测序可能会存在如下风险（以下风险是根据已有项目情况进行总结）：

       reads上碱基分布波动较大。

　　可能导致Q20质量指标较低，正常情况下Q20 > 90%。

　　送样总量低于10ng，对信息分析可能会存在如下风险（以下风险是根据已有项目情况进行总结的）：

　　较低的比对率（之前的案例中出现过比对率仅有30%，），远远低于乙方预设的标准，正常情况下比对率应≥80%   。

　　由于比对率的问题，分析得不到足够的可用数据，对后续分析的准确度有很大的影响，如所定义的富集区域位置不准确，数量不够，以及富集偏差等。