转录组研究揭示褪黑素提高烟草镉耐受性

褪黑激素是一种多功能信号分子，可调节植物对环境胁迫的响应的广泛方面。镉（Cd）是一种持久的土壤污染物，对所有生物都有毒。已有研究表明褪黑素在减轻镉的植物毒性中的保护作用，但对其在植物中的调节机制知之甚少。

近日，合作客户于《Ecotoxicology and Environmental Safety》（IF=4.527）发表关于叶面施用褪黑素后显著增强烟草叶片对Cd的耐受性机制研究。

研究假设


大多数研究褪黑素在Cd解毒或螯合中的应用研究都是在水培法或者土壤中使用番茄、水稻或芸苔。关于褪黑素诱导的烟草植物对Cd胁迫的耐受性的研究很少。本文提出了两种假设：
1）叶面褪黑素的使用提高了烟叶对Cd的耐受性；

2）褪黑素诱导的Cd耐受性与抗氧化能力和Cd相关基因表达有关。

本研究的目的是评估叶面褪黑素对烟叶中镉胁迫的潜在作用。并探索证据表明褪黑素如何在化学和遗传水平上赋予Cd耐受性。

研究设计


1

研究对象


湖南省烟草科学研究所（中国长沙）选择并提供了烟草种子（品种Yun-87）；

2

Cd胁迫处理


烟草种子经过表面消毒处理，培养至长出两片真叶后，将烟苗分别暴露于0、50、100和200μM CdCl2中3d：在100μM Cd处理中观察到最低的根伸长和鲜重（与0μM Cd处理相比降低约50％），并且在用100和200μM Cd处理后抑制根生长没有显着差异。

3

褪黑素处理


选择100μM Cd用于后续实验。将幼苗转移到装有Hoagland营养液（有或没有Cd）。具体而言，用0（CK）、25、50、100和250μM褪黑素（分别表示为CK，MT25，MT50，MT100和MT250）喷洒烟草的叶面部分。培养环境相对湿度为75％的光照过的生长小室中（以200μmol m-2 s-1辐射强度照射14 h，25±1°C；黑暗10 h，23±1°C），4个重复。一周后，收获植物样品并立即测量鲜重和根长。将植物样品研磨并通过0.25 mm的筛子进行进一步分析。

4

理化性质检测


(1)光合特性的测定：幼苗的总叶绿素含量、净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、细胞内CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）。
(2)定量检测H2O2和O2·-
(3)抗氧化酶活性测定：抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、 H+-ATPase酶活性。
(4)组织分级分离和镉分析：将叶子分为四个部分：细胞壁（CW），液泡（V），细胞器（O）和可溶性（S）组分，分别检测Cd浓度。

5

RNA高通量测序


提取烟草根部组织RNA，高通量测序检测。


研究结果


1、褪黑激素抑制Cd对烟草生长的胁迫影响

通过生物量检测发现，褪黑素处理过的植物在有或没有镉胁迫下均具有更好的生长和更强的根发育（下图C）。当浓度低（25或50μmol/ L）时，单独使用褪黑激素对烟叶的鲜重或根长（与CK相比）没有显着影响，施用较高浓度的褪黑激素可显著促进烟草生长。CdCl2显着抑制了烟草幼苗的生长，鲜重和根长分别显著降低了39.1%和39.9%（下图），这表明施用褪黑素可减轻Cd对烟草生长的毒性作用。当浓度为100μM时，褪黑激素最能减轻Cd诱导的抑制作用并促进烟草生长。


2、褪黑素对有或没有镉胁迫的烟叶光合参数的影响

与无镉胁迫对照相比，镉胁迫下所有光合参数均显着降低。在镉胁迫下叶面喷施褪黑素可以有效减轻这些不利影响。与单独的Cd处理相比，中等浓度的褪黑激素显示出最有效的改善作用（100 vs. 25、50或250μM）。另外，褪黑激素作为一种促进生长的分子，在无镉胁迫下增加了所有光合参数，表明褪黑激素可能在调节植物生长发育中发挥作用。


3、ROS积累

与CK（Cd 0μM）处理相比，Cd暴露后，烟草幼苗叶片中的ROS（O2·-和H2O2）浓度显著升高（下图）。褪黑素的应用显著抑制了烟草叶片由于O2·-和H2O2含量降低所导致的氧化损伤。同样，应用100μM褪黑素可导致ROS积累的降低更为明显，O2·-和H2O2含量分别降低了28.3%和29.1%。这些结果表明，叶面施用褪黑激素可以有效地最小化Cd诱导的烟叶中的氧化应激。


4、抗氧化酶和H+-ATPase的活性

研究检测了在单独或联合使用Cd和褪黑激素的各种处理下，烟叶中抗氧化酶（APX，SOD和CAT）和H+-ATPase的活性。所有测试酶均显示出相似的趋势：Cd具有强大的酶活性抑制作用，叶面施用褪黑激素可显著恢复其活性。例如，褪黑素与镉胁迫相结合，与仅镉胁迫相比，其SOD活性提高了37.5%。类似地，与Cd胁迫下的CK相比，添加100μM褪黑素可诱导H+-ATPase活性增加约30.0%。这些结果表明，褪黑素诱导的抗氧化酶和H+-ATPase活性调节赋予烟草叶片Cd引起的氧化胁迫耐受性。


5、镉的积累与分布

过量暴露Cd 污染1周使烟叶中的内源Cd含量大大增加（下图A），而叶面施用褪黑激素与单独的Cd胁迫相比明显抑制了叶片对Cd的吸收。为了探讨褪黑激素对烟草叶细胞中镉的细胞分布的影响，定量了叶片组织细胞室中镉的含量。在所有处理中，Cd的亚细胞分布主要由可溶性和细胞器部分所控制，Cd占总量的65%以上（下图B）。重要的是，叶面褪黑素的使用改变了烟草叶片中Cd的亚细胞分布。在褪黑激素处理下，液泡中Cd的比例和细胞壁部分显着增加，但可溶性和细胞器部分中的Cd水平降低。褪黑激素有利于促进Cd固定化并最大程度地降低其细胞毒性。


6、RNA-seq研究Cd相关基因在烟草根组织中的表达

诸如镉之类的有毒和生物非必需金属可以通过吸收必需养分的相同转运蛋白进入植物。 一旦有毒金属替代或干扰了基本养分的功能，有机体就需要通过生化方法或基因表达的变化来维持这些养分的特定水平。如下图所示，外源褪黑激素极大地改变了在Cd胁迫下烟草叶片中Cd转运基因的转录水平。与单独的镉胁迫相比，褪黑素处理的植物中IRT1、Nramp1、HMA2和HMA4的转录水平显着增加，而在IRT2和HMA3基因中观察到的响应却相反。


7、TEM扫描电镜

为探索可见的证据证明叶面施用褪黑激素可降低Cd的植物毒性，对暴露1周后未经处理，Cd胁迫和100μM褪黑素的根样品进行TEM显微照片。与对照（未处理）相比，镉暴露后的根部横截面表现出相当大的形态和生理差异。根表现出质膜和部分细胞壁的降解，细胞质破坏和根表面杂乱（图5B）。然而，在喷洒褪黑激素后，观察到了完整的细胞结构，在根部没有崩解（图5C）。结果表明，褪黑激素的施用可以有效减轻镉对烟草根细胞的胁迫。


结构方程模型（SEM）分析表明，叶面褪黑素对改善烟叶质量和抑制Cd的植物毒性具有明显的直接影响，褪黑素通过ROS、抗氧化酶活性和Cd相关基因的表达水平间接影响Cd的利用率。


总结

这项研究提供了有趣的证据，支持了文章开始提出的假设，即叶面褪黑激素通过增强抗氧化防御能力，调节Cd相关基因的表达，促进细胞壁或液泡对Cd的螯合而诱导烟草叶片对Cd的耐受性。总之，本文的研究发现为使用褪黑激素作为Cd毒性的拮抗剂提供了令人信服的支持，并为全球可持续烟草生产带来了重大好处。


【参考文献】

Foliar spraying of melatonin confers cadmium tolerance in Nicotiana tabacum L. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019

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