蛋白芯片常见问题

* 蛋白芯片可以应用于哪些研究领域？

蛋白芯片主要分为抗体芯片和蛋白质芯片两大类，前者是不同的抗体形成的微阵列，可以用来高通量相对定量或绝对定量检测某一类型的蛋白质，是疾病的发生、发展的机制研究以及疾病标志物筛选等研究的有力工具；

蛋白质芯片是不同种类的蛋白质形成的微阵列，是功能性芯片的代表。可以进行疾病诊断标志物、抗体特异性、药物靶点等筛选研究，以及蛋白质与蛋白质、核酸、小分子药物、糖类、脂类等的相互作用检测。同时，还可以在此类芯片上进行复杂的酶与底物反应实验，从而确定酶的底物谱，进而广泛用于磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等蛋白修饰研究。

* 哪些类型的样本可用于抗体芯片检测？

细胞裂解物、组织提取物以及血清样本都可用于抗体芯片检测分析。

* 抗体芯片检测是否需要设定对照？

我们推荐使用抗体芯片检测时同时检测对照样本，包括空白对照、造模对照、阳性对照等。

* 抗体芯片检测过程中需要的最低蛋白量为多少？

抗体芯片检测过程中蛋白质需要经过标记与检测两个步骤，需要的最低蛋白量为总蛋白40 －100微克。

* 如果使用细胞样本，获得100微克总蛋白需要多少细胞？

由于细胞类型不同，每个细胞的蛋白含量也不尽相同。我们通常实验中使用 106 － 107 的细胞可提取大约 1 毫克蛋白质，其中大约 100ug 用来进行标记与杂交，因此我们推荐提供 5 × 106 细胞用于抗体芯片检测。

* 准备芯片检测样品前要注意什么？

答：样品尽量新鲜，组织样本冷冻前尽量去除血液等、血清不要有溶血发生、样品不要反复冻融。

* 可以使用除了抗体芯片配套试剂盒中的提取缓冲液以外的蛋白裂解试剂吗？

是的，在细胞或者组织裂解获得蛋白质的过程中是可以使用各种缓冲液的（如：RIPA裂解液），但是这些缓冲液不能包含 Tris 。因为 Tris 组分会影响到下一步的蛋白质标记步骤。因此，在使用含有 Tris 组分的缓冲液获得蛋白质之后，推荐使用 Millipore, Microcon YM-10 filters (Catalog: 42406) 或者 Sephadex G-25 columns 置换成标记缓冲液体系。

* 在裂解过程中需要加入蛋白酶抑制剂吗？

抗体芯片的配套裂解试剂中是不含蛋白酶抑制剂的。样本取来后，会在低温快速的情况下完成蛋白质提取、标记以及杂交过程。如果您需要自己裂解样本，那么推荐您在蛋白质裂解过 程中加入蛋白酶抑制剂。

* 在抗体列表中经常会有这样的情况 p53(ab-15) 或者 p53(phospho-Ser15) ，应该怎样理解？

括号中的数字说明这是该蛋白的磷酸化位点位置。 p53(Ab-15) 和 p53(phospho-Ser15) 的区别是：抗体 p53(Ab-15) 是使用围绕 p53 Serine 15 位点周围的一段合成的多肽制备的，其中 Serine 15 为非磷酸化状态；而抗体 p53(phospho-Ser15) 也是使用围绕 p53 Serine 15 周围的一段合成的多肽制备的，而其中 Serine 15 位点为磷酸化状态。因此抗体 p53(Ab-15) 只能识别非磷酸化状态 Serine 15 ，而抗体 p53(phospho-Ser15) 可以识别磷酸化状态 Serine 15，这两个抗体在芯片上是配对的。

* 在磷酸化抗体芯片中，为什么往往一个蛋白会有多个抗体对应？

由于一个蛋白质往往具有不同的磷酸化位点，这些位点的不同磷酸化水平又对应不同的功能状态。而我们抗体芯片上的抗体是特异针对每个磷酸化位点的，因此一个蛋白由于具有多个磷酸化位点往往会有多个抗体对应。例如 c-Jun(Phospho-Thr91) 只检测 c-Jun 的Threonine 91 的磷酸化状态，而 c-Jun(Phospho-Tyr170) 只检测 c-Jun 的 Tyrosine 170 的磷酸化状态。

* 信号通路抗体芯片是怎么检测信号通路的？

针对每一条信号通路，如p53：从细胞膜到胞浆到核内，参与整条信号通路的蛋白质均设置抗体进行检测，针对某些蛋白会有多个磷酸化位点的情况，我们也会设置多个磷酸化位点的特异抗体进行检测。将这些抗体固相结合到一张芯片片基上，以实现对于一个样本中整条p53通路的检测。同时，我们还设计有广谱筛选芯片，将多条信号通路中的相关蛋白特异抗体固相结合到芯片片基上，从而实现对信号通路蛋白的广谱筛选。

* 蛋白芯片可以给出定量结果吗？

蛋白芯片可以给出定量结果。一般情况研究目的仅为比较对照样本间某些指标的差异，通过差异反应和解释生物现象则只需要进行半定量检测。一般检测生物流体里的蛋白质，尤其是分泌蛋白，需要进行绝对定量检测，进行绝对定量检测方便后续临床应用的转化过程，以及与现有文献进行对比。

* 蛋白芯片的灵敏度、重复性、动态检测范围怎样？

蛋白芯片基本采用荧光检测，其灵敏度要比ELISA(比色法)、Western（化学发光法）更加灵敏和稳定。片内和片间的技术重复相关系数R2均可以达到0.9以上。定量检测其检测范围与标准品的线性范围有关，检测灵敏度可达到 pg/mL级别。