表观遗传失调介导的COL12A1上调预示肝内胆管癌患者的预后不良

研究背景

肝内胆管癌(iCCA)是一种高度恶性肿瘤，预后较差。近年来，肝内胆管癌的全球发病率和死亡率均呈上升趋势。由于缺乏疾病特异性的生物标志物用于肝内胆管癌的早期诊断，大多数肝内胆管癌患者确诊时已经是晚期，可用的系统治疗效果很差。因此，迫切需要鉴定新的肿瘤特异性生物标志物，作为可药物靶点，以发现新的治疗药物，用于肝内胆管癌的个性化治疗。

基因组和转录组测序在过去十年为肝内胆管癌的分子病因提供了有价值的视角。因此，一些结合FGFR2、IDH1或IDH2的分子抑制剂被开发用于治疗携带FGFR2融合或IDH1/2突变的晚期肝内胆管癌患者。最近也有研究从蛋白质组学的角度为肝内胆管癌的分子发病机制提供了新的视角。然而，对不同组学数据集进行整合分析，从中揭示肝内胆管癌的共同特征和肿瘤特异性分子标志物的研究还很缺乏。

研究路线

TCGA、GEO或ArrayExpress数据集的差异分析显示，有2696个共同异常表达基因。其中，1027个基因也在TCGA的肝细胞癌(HCC)数据集中异常表达，剩余的1669个基因被鉴定为潜在的肝内胆管癌特异性mRNA生物标志物。WGCNA分析显示，这些潜在的肿瘤特异性生物标志物聚类于6个基因表达模块中。在E-MTAB-6389队列中，brown模块(MEbrown)与肝内胆管癌的坏死检出呈正相关，与患者的总生存时间呈负相关，故而是作者感兴趣的模块。对brown模块中76个基因的聚类分析显示，与非肿瘤肝组织样本相比，除7个mRNA生物标志物：LRRC25、ZDHHC14、OVGP1、MRPS28、MTMR4、GRTP1和L2HGDH在肝内胆管癌中下调外，其余检测到的mRNA生物标志物均显著上调。

富集分析表明，所鉴定的mRNA生物标志物显著富集于7个主要生物过程，包括：自然杀伤细胞介导的细胞毒性、氨基多糖分解代谢过程、脂肪酸衍生物生物合成过程、动物器官鉴定、硫酸软骨素代谢过程、氨基糖代谢过程和生殖过程。火山图表明，COL12A1、IL8、CD248、ANTXR1和THBS2是brown模块中表达上调最显著的5个基因。考虑到肝内胆管癌是一种富含胶原蛋白的恶性肿瘤，在brown模块中鉴定的差异表达基因中，COL12A1的表达倍数变化排名第一。作者接下来研究并验证了COL12A1在肝内胆管癌中的表达谱、临床意义、上游调控机制和生物学作用。

2、COL12A1在肝内胆管癌临床样本中表达上调

对多个转录组数据集的整合分析显示，相对于癌旁非肿瘤组织或肝癌组织，COL12A1在肝内胆管癌组织中的mRNA表达显著上调。与组学数据一致，免疫印迹和RT-PCR实验证实，COL12A1在肝内胆管癌组织标本中的mRNA和蛋白水平均显著过表达。同时，与正常肝内胆管细胞相比，COL12A1在肝内胆管癌细胞中的mRNA和蛋白表达均上调。此外，在临床肝癌组织和非肿瘤肝组织组织中，COL12A1的mRNA和蛋白表达相似；而COL12A1的蛋白表达在人肝癌细胞系中相对于正常肝细胞系HL7702下调。免疫组化和免疫荧光染色显示，COL12A1蛋白在肝内胆管癌细胞质、细胞核以及细胞外基质中均有表达。

3、COL12A1在肝内胆管癌中表达上调且与不良临床结果相关

COL12A1在TCGA、OEP001105或LVC1202队列的晚期肝内胆管癌患者中的表达显著增加。作者通过最佳截断值：TCGA（11.375）、E-MTAB-6389（6.02）、OEP001105（5.255），将肝内胆管癌患者分为：COL12A1 mRNA高、低表达组。生存分析显示，在TCGA、E-MTAB-6389或OEP001105队列中，COL12A1 mRNA高表达的肝内胆管癌患者的预后明显比COL12A1 mRNA低表达的肝内胆管癌患者差。对两个独立的肝内胆管癌队列：OEP001105和LVC1202的分析表明，COL12A1蛋白水平表达上调对肝内胆管癌患者的预后有不利影响。在TCGA、OEP001105、E-MTAB-6389和LVC1202队列中，COL12A1高表达的肝内胆管癌患者的中位总生存时间明显短于COL12A1低表达的肝内胆管癌患者：18.55(10.16-29.54)个月比53.45(29.62-75.53)个月，p=0.014。同时，COL12A1高表达组患者的复发风险更高。此外，多因素分析表明，COL12A1的高表达是与肝内胆管癌患者预后不良相关的独立风险因素。

4、COL12A1在肝内胆管癌和配对非肿瘤组织中的启动子甲基化模式

为了研究COL12A1在肝内胆管癌中表达上调的上游机制，作者首先分析了两个独立的临床肝内胆管癌的DNA甲基化数据集，确定了COL12A1启动子和增强子区域的甲基化模式。在TCGA和GSE156299数据集中，COL12A1增强子区域的甲基化程度在肝内胆管癌组织和癌旁非肿瘤肝组织中相似；TCGA数据集中，COL12A1启动子区域的甲基化程度在肝内胆管癌组织中明显高于配对非肿瘤肝组织；而在GSE156299数据集中，COL12A1启动子区域的甲基化程度在两组间无显著差异。此外，COL12A1的几个位点：cg03564793、cg14375912、cg04074140和cg19132213，在肝内胆管癌组织中的甲基化程度与癌旁非肿瘤组织相比显著升高，说明COL12A1启动子的甲基化模式并不是其在肝内胆管癌中表达上调的原因。

5、MiR-424-5p在肝内胆管癌细胞中与COL12A1的mRNA直接结合

TargetScan数据库(version 8.0)的预测分析表明，7个候选miRNAs：miR-424-5p、miR-15a-5p、miR-497-5p、miR-15b-5p、miR-6838-5p、miR-16-5p和miR-195-5p均可以与COL12A1的3'UTR区结合。配对和非配对分析均表明，相对于癌旁非肿瘤组织，miR-424-5p在肝内胆管癌中的表达显著降低。除了miR-6838-5p在TCGA数据集中未检测到外，其余候选miRNA在肝内胆管癌和癌旁非肿瘤组织之间表达水平相似。相关性分析显示，在TCGA数据库中，miR-424-5p与COL12A1 mRNA的表达呈显著负相关。此外，与正常肝内胆管细胞HIBEpiC相比，miR-424-5p在人肝内胆管癌细胞中的表达显著下调。

免疫印迹实验表明，miR-424-5p的过表达可以抑制HuCCT1和RBE细胞中COL12A1的表达。荧光素酶报告实验显示，在共转染miR-424-5p与COL12A1野生型3'UTR的HEK-293T细胞中，荧光素酶活性显著降低；在共转染miR-424-5p与COL12A1突变3'UTR的HEK-293T细胞中，荧光素酶活性显著升高。RT-PCR结果显示，miR-424-5p的过表达可下调HuCCT1和RBE细胞中COL12A1的mRNA表达。此外，作者通过内部肝内胆管癌数据集对miR-424-5p在肝内胆管癌中的下调以及COL12A1 mRNA与miR-424-5p表达的负相关进行了验证。这些结果表明，miR-424-5p可以通过直接靶向COL12A1的mRNA而导致COL12A1的翻译抑制或降解。

6、miR-424-5p启动子区的高甲基化调控其在肝内胆管癌中的表达下调

为了确定miR-424-5p在肝内胆管癌中下调的上游调控机制，作者通过靶向亚硫酸氢盐测序在10对肝内胆管癌样本中检测了miR-424的启动子甲基化模式。结果显示，与配对的非肿瘤组织相比，miR-424启动子区CpG位点的甲基化程度在肝内胆管癌中显著升高。在肝内胆管癌中，miR-424启动子甲基化程度与miR-424-5p表达呈显著负相关。此外，DNA甲基转移酶(DNMTs)在转录水平上与miR-424家族成员呈表达负相关。这些结果表明，DNMTs介导的启动子CpG位点高甲基化导致肝内胆管癌中miR-424-5p下调。

作者用地西他滨处理肝内胆管癌细胞，以评估DNA去甲基剂是否可以通过诱导miR-424启动子去甲基化而抑制COL12A1的表达。免疫印迹检测显示，经地西他滨处理后，COL12A1在HuCCT1和CCLP1细胞中表达降低。靶向亚硫酸氢盐测序显示，在HuCCT1和CCLP1细胞中，miR-424启动子区CpG位点的甲基化程度在地西他滨处理后降低。RT-PCR结果显示，经地西他滨处理的HuCCT1和CCLP1细胞中，miR-424-5p的表达增加，而COL12A1 mRNA表达降低。此外，与对照组相比，COL12A1在地西他滨处理组的皮下异种移植瘤中的表达水平较低。总的来说，这些发现表明，DNMTs介导的miR-424-5p下调导致了肝内胆管癌细胞中COL12A1上调。

7、COL12A1促进肝内胆管癌细胞在体内外的增殖和生长

为了评估COL12A1对肝内胆管癌细胞进展的影响，作者使用COL12A1 CRISPR/Cas9 KO质粒分别在HuCCT1和RBE细胞中使COL12A1表达沉默。细胞活力测定结果显示，COL12A1的表达敲除减弱了HuCCT1和RBE细胞的增殖。集落形成实验表明，COL12A1的表达敲除通过减弱iCCA细胞的集落形成能力而抑制肿瘤细胞的生长。皮下异种移植模型实验结果显示，COL12A1的表达敲除抑制了肿瘤的生长和增殖。

8、COL12A1在肝内胆管癌中与上皮间充质转化进程呈正相关

作者在E-MTAB-6389、TCGA和OEP001105数据集中进行了相关性分析，结果表明，COL12A1和EMT相关标记物：VIM一样，均与EMT基因集显著正相关。免疫印迹显示，COL12A1的表达敲除可增加HuCCT1和RBE细胞中上皮标志物：E-cadherin的表达，而减少间充质标志物：N-cadherin和vimentin的表达。这些发现表明，COL12A1的上调在维持肝内胆管癌细胞的EMT进程中起着关键作用。

9、miR-424-5p在肝内胆管癌中海绵吸附COL12A1的治疗价值

MiR-424-5p的过表达可抑制肝内胆管癌细胞的生长、侵袭和迁移。然而，miR-424-5p在体内是否具有抗肿瘤潜能尚不清楚。为了评估miR-424-5p在肝内胆管癌中的治疗效果，作者通过尾静脉给药miR-424-5p激动剂(Ago-miR, 20 nmol /只小鼠)来治疗荷瘤小鼠。在异种移植模型中，与对照组相比，AgomiR治疗组的肿瘤生长明显受到抑制。而且，与对照组相比，COL12A1在AgomiR治疗组中的表达降低。

研究结论

作者的研究确定了COL12A1在肝内胆管癌进展中的关键作用。机制上，miR-424-5p在肝内胆管癌中由于其启动子区CpG位点的高甲基化而表达下调；miR-424-5p可以直接与COL12A1 mRNA结合，故而miR-424-5p的下调有助于COL12A1的表达上调，从而促进了肝内胆管癌的进展。

作者提出，COL12A1是肝内胆管癌表观遗传治疗的一个有前景的药物靶点；miR-424-5p对COL12A1的靶向作用在肝内胆管癌中具有治疗潜力。

参考文献

Tang, Zengwei, et al. "Epigenetic dysregulation-mediated COL12A1 upregulation predicts worse outcome in intrahepatic cholangiocarcinoma patients." Clinical Epigenetics 15.1 (2023): 1-20.