铁死亡相关基因signature构建预测肝癌总体生存

最近发表在International Journal of Biological Sciences杂志（IF：4.858），文章主要讲的是基于铁死亡相关基因构建癌症的预后signature。这样构建预后风险signature的经典方式文章一直有在接收出版，公众号也推过无数，思路清晰简单完整，无外乎是：1、找一个感兴趣的基因集；2、降维筛选预后因子；3、再次降维构建预后风险signature；4、效能验证。

铁死亡相关基因signature构建预测肝癌总体生存
一、摘要
肝癌是一种高度异质性癌症，铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖的细胞死亡形式（可通过索拉菲尼（sorafenib）诱导铁死亡）。铁死亡相关基因的在肝癌中的预后价值还有待进一步研究。本研究基于TCGA数据集，筛选预后相关的差异因子，通过Lasso-cox回归模型构建了一个包含10基因癌症预后signature，将肝癌划分了高低风险组，高风险组OS显著的低于低风险组（p<0.001）。此外,研究使用ICGC肝癌数据集用于预后signature的验证，同样得到了相似的结果（p=0.001）。ROC曲线分析也验证了signature的预后效能。
流程图：

图1：流程图
二、数据及方法
数据集
分析数据集：TCGA-LIHC 371个肝癌患者RNA-seq数据和临床信息(https://portal.gdc.cancer. gov/repository);
验证数据集：ICGC (LIRI-JP) 231肝癌样本RNA-seq数据和临床信息(https://dcc.icgc. org/projects/LIRI-JP) ;
TCGA和ICGC数据集临床信息见表1。

表1：训练集和验证集临床信息表
预后铁死亡相关基因signature的构建和验证
首先，筛选TCGA肝癌和癌旁间的差异基因DEGs（R包：limma，p-adj<0.05）；其次，使用单因素cox回归分析筛选肝癌预后相关的铁死亡因子（ 通过Benjamini & Hochberg (BH)校正p值 ）。然后与DEGs取交集得到构建signature的候选基因，使用String数据库基于这些候选基因构建PPI蛋白互作网络，研究候选因子的互作关系；最后，使用lasso回归分析进一步筛选肝癌预后因子（R包：glmnet），根据每个候选因子的表达和lasso回归系数计算患者风险评分:score= esum (each gene’s expression × corresponding coefficient)。根据得分中位值将肝癌样本划分为高风险和低风险组，使用R 包：stats进行主成分分析（PCA），使用R包：Rtsnet-SNE进行分组的可视化。每个候选基因的生存分析表达最佳切点由R包：survminer执行，ROC曲线分析则使用R包：survivalROC来评估signature的预测能力。
功能富集分析
对高低风险组差异表达基因DEGs进行GO功能、KEGG通路富集分析（R包：clusterProfiler）；16种免疫细胞浸润得分和13条免疫相关通路活性得分则由单样本基因集富集分析（ssGSEA，R包：gsva）执行。
统计分析
所有的统计分析都基于R 软件 (Version 3.5.3) 或者SPSS (Version 23.0)
三、结果解析
1. TCGA识别铁死亡相关差异基因
81.7%的铁死亡相关基因在癌症和正常中表现出差异，其中27个与肝癌预后相关（图2a）。要注意的是，HMOX1在癌症中显著上调，但是表现出良好的预后，其它基因高表达与更差预后相关，因此剔除该基因，使用剩下的26个铁死亡因子进行后续分析（图2b-c）。基于这些候选因子构建PPI互作网络,GPX4, G6PD和NQO1为核心基因（图2d）,铁死亡预后因子相关性分析（图2e）。

图2. TCGA识别候选的铁死亡相关基因
二、TCGA数据集构建预后模型
在Lasso、cox回归分析基于TCGA 26个铁死亡候选因子，最终构建了包含10个基因的预后signature（公式比较复杂这里就不放了，想看的话可以联系客服要文献哦），根据中位数将样本划分高风险（182）和低风险（183）组（图3a）。高低风险样本在临床指标中的分布见表2。PCA和t-SNE分析结果表明signature能很好的将两组样本区分（图3b-c）,高风险患者死亡风险显著高于低风险患者，OS生存期也更差（图3e,p<0.001）。ROC曲线评估风险评分的OS预测效能AUC值（1年0.8，2年0.69，3年0.668）。

图3. TCGA 10-genes signature模型预后分析
三、预后signature ICGC数据集验证
基于ICGA数据集对signature包含的10个基因做生存分析，除CARS外都与更差的OS相关。ICGC队列的患者也按照与TCGA队列相同的公式计算的中值分为高低风险组，测试由TCGA队列构建的模型的鲁棒性。得到了与TCGA相似的结果，ICGC高低风险样本在临床指标中的分布见表2。PCA和t-SNE分析结果也表明signature能很好的将两组样本区分（图4b-c）,高风险患者较低风险患者相比生存期更短（图4e,p=0.001）。ROC曲线评估风险评分的OS预测效能AUC值（1、2、3年分别为0.68、0.69、0.718）。

图4.ICGC 10-genes signature模型验证

表2：TCGA和ICGC队列高低风险组临床指标特征

四、 10-genes signature模型独立预后价值
单因素、多因素cox回归分析确定risk score是肝癌OS独立的预后指标。单因素cox回归分析发现risk score 在训练和验证数据集中都是肝癌显著相关的OS预后因子（图5a-b,TCGA p<0.001,ICGC p=0.006）。校正其他混杂因素后，在多变量Cox回归分析中，risk score仍被证明是OS的独立预测因子（图5a-b,TCGA p<0.001,ICGC p=0.005）。

图5.TCGA和ICGC数据集risk score为肝癌独立预后因子验证
五、TCGA和ICGC数据集功能分析
为了阐明risk score相关的生物学功能和通路，对高低风险组的差异基因进行了GO、KEGG富集分析。不出所料，DEGs富集到了铁相关的几种生物学过程（图6a.c）。有趣的是TCGA的DEGs也显著的富集到了许多与免疫相关的生物学过程（图6a）,ICGC队列也得到了相似的结果（图6c）。KEGG通路分析表明两个数据集中均富集到了cytokine-cytokine 互作通路（图6bd）。

图6.GO、KEGG富集分析结果TCGA（ab）、ICGC（cd）
六、risk score与免疫浸润细胞相关性分析
为了进一步研究risk score与免疫状态相关性，研究使用ssGSEA量化了免疫细胞得分和免疫相关功能、通路得分。结果表明，TCGA队列中抗原呈递过程相关得分高低风分组中显著差异（P-adj <0.05，图7a-b）,高风险有更高cytokine-cytokine 互作通路得分（图7b）。高风险组 II型IFN反应、 I型IFN反应、NK细胞得分更低，免疫检查位点活性、而巨噬细胞、Treg得分则相反（P-adj <0.05，图7a-b）。ICGC队列验证了两个风险组之间的HLA，I型MHC，II型IFN反应，检查点分子，巨噬细胞、Treg细胞的差异（校正后的P <0.05，图7c-d）。特别是，两个数据集中巨噬细胞得分在统计学上差异最大，这与GO分析中的发现是一致的。

图5. TCGA（a-b）he ICGA(c-d)高低风险分组ssGSEA差异（ac-16种免疫细胞得分，cd-13种免疫功能得分）

总结：

研究癌型特别相关的基因集，要用好数据（分析+验证样本不要太小结果好一些）！

转自生信人

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