高分辨率全长16s rRNA技术鉴定大西洋鲑微生物

Full-length 16S rRNA gene classification of Atlantic salmon bacteria and effects of using different 16S variable regions on community structure analysis3.142Microbiologyopen . 2019 Oct;8(10):e898. doi: 10.1002/mbo3.898. Epub 2019 Jul 4.

Abstract

Understanding fish-microbial relationships may be of great value for fish producers as fish growth, development and welfare are influenced by the microbial community associated with the rearing systems and fish surfaces. Accurate methods to generate and analyze these microbial communities would be an important tool to help improve understanding of microbial effects in the industry. In this study, we performed taxonomic classification and determination of operational taxonomic units on Atlantic salmon microbiota by taking advantage of full-length 16S rRNA gene sequences. Skin mucus was dominated by the genera Flavobacterium and Psychrobacter. Intestinal samples were dominated by the genera Carnobacterium, Aeromonas, Mycoplasma and by sequences assigned to the order Clostridiales. Applying Sanger sequencing on the full-length bacterial 16S rRNA gene from the pool of 46 isolates obtained in this study showed a clear assignment of the PacBio full-length bacterial 16S rRNA gene sequences down to the genus level. One of the bottlenecks in comparing microbial profiles is that different studies use different 16S rRNA gene regions. Comparisons of sequence assignments between full-length and in silico derived variable 16S rRNA gene regions showed different microbial profiles with variable effects between phylogenetic groups and taxonomic ranks.   

Keywords: Atlantic salmon; Full-length 16S rRNA gene sequence; microbiota.

大西洋鲑鱼（Salmo salar）也就是俗称的三文鱼，是一种溯河产卵的鱼类，由于其丰富的营养价值和鲜美的口感受到人们的喜爱。大西洋鲑对河流水质要求较高，这使得大西洋鲑鱼成为河流水质的一个重要生物指标。而鱼类的生长发育受到消化系统和鱼类表面的微生物群落影响，研究这些微生物群落将有助于增进对水产养殖业微生物的了解。

二代测序技术主要通过16s rRNA基因的部分序列进行分析，但不同的研究人员对不同细菌的16s rRNA基因区域进行分析，使得微生物组研究很难在全局水平上进行比较。而全长16s rRNA基因与可变区之间的微生物多样性也会存在差异，不同高变区短读长扩增子的PCR引物选择会影响推断的群落准确性和某些细菌类群的敏感性。因此，全长16s rRNA技术为提高微生物群落的分类学分辨率提供了一种新的方法。

2019年，《MicrobiologyOpen》杂志发表了结合可培养方法和全长16s rRNA技术，收集大西洋鲑皮肤和肠道样本，分析微生物群落多样性，分析全长16s rRNA和不同16s可变区的分类学差异。

1. 样本采集

2. 细菌分离鉴定

3. 全长扩增子测序

1. 微生物组成比较分析

主成分的层次聚类分析结果表明，皮肤粘液和肠道微生物均能分类到属，皮肤粘液微生物聚类紧密，肠道菌群相对分散，但在属水平上，肠道菌群按饮食聚类的特征明显。属水平上，皮肤粘液样本中优势类群主要为黄杆菌（51.2%）和假单胞菌（40.7%）为主，肠道中的优势类群包括乳杆菌（35%）和梭菌（26.1%）等。

为了确定全长16s rRNA是否具有更高的分辨率，研究从全长16s rRNA数据集中提取了v3_v4和v5_v6区的部分序列。研究分析了不同分类层级的分辨率，只有全长16s rRNA序列能够鉴定到种水平（图2）。同时，文章选择食肉菌属（Carnobacterium）深入研究，发现相比全长数据集，v3v4和v5v6序列分配给食肉菌的序列更多，说明16s rRNA的部分高变区具有偏好性，会影响获得的微生物谱结果。

图1. 大西洋鲑皮肤（SM）和肠道（I）在目（a）和属（b）水平的分层聚类热图

图2. 不同分类水平层级全长16s、v3_v4区和v5_v6区的分辨率（a）；不同区域共有和特有的taxa分类数（b）

培养方法能够提供代表性的分离株，通过对细菌菌落进行表型分类获得46个代表菌落，结合16s rRNA比对结果这些菌落能够分配到7个属，食肉杆菌在寡营养和富营养平板上均占主导地位。

研究通过获得的分离株16s rRNA与全长16s rRNA库比对的方式研究可培养细菌占比，下图展示的是46个代表菌落在全长16s rRNA序列库中的分布情况，可培养细菌仅占3.99%。通过比较分配给该属的OTU相对丰度，发现在皮肤粘液中，黄杆菌和嗜冷杆菌占主导地位，肠道样本以食肉杆菌为主。

研究利用全长16s rRNA测序技术，获得并鉴定了大西洋鲑皮肤粘液和肠道样本微生物群落组成，揭示受到饲料影响的微生物组与“正常”微生物群落之间的差异，结合培养方法分离的共生微生物，能够用于研究与宿主之间的关系，有助于增进水产养殖业对微生物影响的了解。同时作者也提出，在研究过程中有些海洋生物的代表菌株难以检出，可能是数据库中海洋相关微生物收录不足引起的。