三代全长转录组测序(Iso-Seq)

近年来，随着高通量测序技术的发展，转录组测序已经成为研究基因表达调控的主要手段。我们知道，很多物种的转录本非常多样和复杂，绝大多数真核生物基因不符合“一基因一转录本”的模式，这些基因往往存在多种剪切形式。通过二代测序，可以很准确地进行基因的表达及定量的研究，但是由于读长的限制，不能得到全长转录本的信息。因此，基于三代测序平台的全长转录组成为新的研究热潮。

全长转录组（Full-length transcriptome）是基于PacBio和Nanopore三代测序平台，无需打断拼接，直接获得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全长序列及完整结构信息，从而准确分析有参考基因组物种可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接较短、信息不完整的难题。同时还可以借助二代测序数据，进行转录本特异性表达分析，获得更加全面的注释信息。

图1 大鼠中已证实的全长转录本

全长转录组测序原理

实验流程

ShiYanLiuChen

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全长转录组测序过程中，为了避免短片段文库偏好性，保证不同长度转录本的覆盖度，因此，会构建3个或3个以上文库：1-2kb、2-3kb和≧3kb文库。

图2 全长转录组实验流程

CCS测序(滚环测序)

GunHuanCeXu

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全长转录组采用单分子实时测序技术，通过构建哑铃型文库，以环形方式循环测序。测序时，短片段文库更容易落入零模波导孔（ZMWs）。

图3 全长转录组CCS测序

  • Polymerase read: 三代测序直接读取的序列，包含接头和插入片段；

  • Subreads: 将Polymerase read接头去除，插入片段每测一次，生成一条subread；

  • CCS read: 来源于同一条Polymerase read的subreads (至少两条)生成的一致性序列。

全长转录项目设计

针对有参考基因组的物种，全长转录组信息可以纠正基因组的错误组装、更准确地发现新的转录本和基因、分析基因融合事件等。

针对参考基因组不完善的物种，全长转录组可优化基因结构，辅助基因组组装和注释，提高基因表达量准确性和数据利用率。
针对无参考基因组的物种，通过三代全长转录组测序来构建物种Unigene库，无需进行序列组装，就可以获得该物种转录组水平的参考序列（转录组水平的参考基因组），为后续研究提供很好的遗传信息基础。
转录组具有时空特异性，根据研究目的进行实验设计，如下：

图4 全长转录组实验设计

建议2+3代转录组测序技术同时使用，保证结构准确性、序列完整性及序列表达量准确性，达到数据的最优利用效果以及性价比最高。针对不同要求及目的，对于大部分物种来说推荐测序数据量8-12G，研究低表达基因、可变剪切事件、多倍体或者基因数目较多的物种，需适量增加数据量。

全长转录组分析流程

获得原始测序序列（Sequenced Reads）后，通过如下流程进行生物信息分析：

图5 全长转录组生物信息分析流程

全长转录组测序优势

  • 无需进行转录本拼接，能够直接获得全长转录本序列，从而更真实的反映测序物种的转录组信息；

  • 能够检测多种可变剪切形式，发现更多的剪接位点和可变剪切事件；

  • 能够发现新的功能基因，补充基因组注释；

  • 有助于融合基因、同源基因、超家族基因或等位基因的精确分析；

  • 专业的生信分析团队，项目经验丰富。

送样要求

  • RNA样品总量要求

一般总RNA>5 ug/文库，总量>15 ug（3个文库），浓度≧250ng/ul。

  • RNA样品质量要求

OD260/280≧1.8，OD260/230≧1.0，260nm处有正常峰值；总RNA的RIN值≧8.0，28S/18S≧1.3。

  • 避免cDNA损伤

采用安全染料，避免EB和紫外照射对cDNA造成损伤。

总之，三代全长转录组对于有参物种和无参物种均适用，获得更多的转录调控事件，从而更真实的反映测序物种的转录组信息。
目前，全长转录组测序研究基因结构已经成为发文章的趋势，研究物种包括高粱、玉米、拟南芥、鸡、人和小鼠、毛竹、棉花等。云生物提供专业的全长转录组测序及分析服务，助力您的研究
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