KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂

　　甲基化研究时，亚硫酸盐处理将未被甲基化的C转变成U，导致基因片段中存在U。高保真酶因为有修复错配的功能，所以扩增过程中遇到U时会将其认作错误碱基进行切断，导致反应无法继续进行。KAPA HiFi Uracil+是在KAPA HiFi的基础上进行了改造，使其在PCR反应过程中遇到U不会终止反应，保证反应的正常进行。

1、主要应用

（1）二代测序中甲基化文库扩增；   

（2）其他甲基化研究。

2、技术优势

（1）可扩增含U的基因片段；

（2）快速、高效；   

（3）产物Bias少；

（4）可扩增高AT/GC模板；   

（5）文库覆盖度高。

3、产品特点

（1）dUTP的存在对扩增无影响

上图：实时荧光PCR扩增含Uracil体系，显示dUTP对KAPA Uracil+无抑制作用。用SYBR Green荧光定量PCR监测452bp基因的扩增情况，模板10倍梯度稀释（80pM-0.8fM)，一组含有0.2mM的dUTP，另一组不含dUTP。扩增用的试剂分别为KAPA HiFi、KAPA HiFi Uracil+。结果显示KAPAHiFi在dUTP存在的情况下显著被抑制，而KAPA HiFi Uracil+则不受影响制。

（2）高效扩增经过亚硫酸盐处理的人类全基因组文库

亚硫酸盐处理容易造成DNA损伤和降低DNA产物量。所以扩增时，因为抑制剂的存在、高A/T含量、DNA受损伤等因素叠加，导致了PCR产物量偏低、片段尺寸不合适、GC Bias等负面情况的发生。为了对比KAPA HiFi Uracil+与安捷伦的Pfu Turbo Cx，我们对比扩增亚硫酸盐处理之后的人类基因组文库，验证文库扩增产量和扩增Bias。

用KAPA文库制备试剂盒制备片段长度为200-400bp的人类基因组文库，模板为5μg人类基因组DNA。亚硫酸盐处理之后，用KAPA文库定量试剂盒进行定量，发现约2.7%未转化基因组DNA残留。分别用KAPA HiFi Uracil+和安捷伦Pfu Turbo Cx扩增未稀释的亚硫酸盐处理后基因组DNA，然后再Bioanalyzer2100上进行分析扩增产物，结果如下图所示。

　　上面3幅图所示：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增的文苦苦产量更高（图B），扩增批次间Bias更少（图C）。扩增循环数分别为12、14或16个，产物的分析采用Bioanalyzer2100（图A）。

（3）扩增高A/T真菌全基因组文库

上图：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增产物量较高，片段尺寸相对较大。（Bioanalyzer2100分析）。

　　如上两图所示：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增甲基化文库优势明显，主要体现在覆盖深度以及扩增高AT/GC模板上。以上两图的结果为寄生虫基因组DNA经亚硫酸盐处理后，分别用安捷伦Pfu Turbo Cx和KAPA HiFi Uracil+扩增后经lllumina GAllx测序后的结果。

（4）人类甲基化测序：USC Epigenome中心用KAPA HiFi Uracil+评价人类基因组甲基化文库测序

4、产品信息