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细胞间的差异在多细胞生物中普遍存在。对单个细胞进行测序可以评估基因表达的异质性及相似类型或来源的细胞之间的异质性，并为鉴定细胞群、分类和亚型提供基础。传统的文库转化率只有所有转录本的10-20%。因此，目前的单细胞方法依赖于对数千个细胞进行测序通过增加数据测序深度来弥补低转换效率。然后只使用高丰度的marker转录本对细胞进行聚类。Lexogen的LUTHOR 3’mRNA-Seq Library Prep Kit使用专有的THOR扩增技术(T7高分辨率原始RNA扩增技术)，使RNA-Seq从单个细胞或超低RNA input量具有前所未有的灵敏度。

THOR扩增技术和LUTHOR 3’mRNA-Seq

THOR稳定的扩增技术可对内源性mRNA模板直接进行线性复制生成更多RNA拷贝(图1)。原始mRNA与扩增所需的T7启动子融合。然后，RNA模板在体外转录产生反义RNA拷贝，但缺乏启动子序列。只有原始的mRNA分子作为模板，并被反复放大。

从而提高RNA浓度，制备文库。文库是在一个高度特异性的链转换步骤中生成的(图1)。完整的LUTHOR工作流没有连接、模板转换和打断 ，因此可用于具有挑战性的样本。通过PCR扩增得到单链的cDNA，并引入与Illumina平台兼容的用于簇生成和i5、i7位置的UDIs的全长接头。Lexogen提供预混合的12nt UDIs index(Cat. No. 101 - 105, 156)。

工作流程

图1 | THOR扩增和RNA-Seq文库模板生成。

无与伦比的灵敏度

对超低RNA的input (UHRR)和单细胞，LUTHOR 3' mRNASeq可提供前所未有的灵敏度。

表1 LUTHOR提供前所未有的灵敏度

*从生产商的说明[1]和已发表的标杆研究[2,3]中获得，每样品1M的数据量，阈值>1(CPM)。更多信息和参考文献[1-3]，请访问www.lexogen.com。表中显示了3 -Seq和全转录组测序(WTS)方法。* *为学术发表的方法。

LUTHOR可靠地从1 M reads/样品的超低RNA input 量(10 - 100pg 通用人类RNA参考样品, UHRR)中检测到约13000 - 16000个基因(图2a)。对于单个HEK293T细胞，可检测到约11000-12500个基因。一个小得多的单个小鼠胚胎干细胞(mES)可检测到约9,500-10,500个基因，而每一个果蝇S2细胞可检测到约6,000-7,000个基因(图2b)。

对于超低RNA input量(通用人类参考RNA，UHRR)的基因检测，LUTHOR和NEBNext Sigle Cell/low nput试剂盒两者比较：LUTHOR在超低input量(10 pg)中比NEB可靠地检测出超300%以上的基因数，在低input量(50 pg)中比NEB可靠地检测出约超60%以上的基因数。样品在NextSeq 500上测序，LUTHOR的数据量为2 M reads/样品, NEB的为3 M reads/样品（图3）。

图2 | LUTHOR 3’mRNA-Seq能够在低测序深度下实现高灵敏度和一致性的基因检测。A)LUTHOR文库来自超低input的UHRR(4个重复)或B)来自冷冻的单个HEK293T细胞、单个mES细胞和单个S2细胞(每个细胞类型8个重复)。文库进行测序，1 M reads/sample数据量进行基因检测分析。检测到的基因数以>1/百万(CPM)为阈值进行计算。

图3 |LUTHOR VS NEBSingle Cell/Low Input.相同的input量情况下，即使NEB测序的数据量更多，LUTHOR也比NEB检测到更多的基因数。

对于超低input量和单细胞测序可获得高质量结果表现

LUTHOR 3 mRNA- seq可靠地展现出内源性mRNA的组成，并有效地排除了核糖体rRNAs，测序序列主要集中在编码序列(图4)。因此，对于超低input样本到单细胞水平的基因表达分析，LUTHOR是最佳选择。

图4|LUTHOR 3 mRNA-Seq reads单一比对的分布特征，以10和100 pgUHRR或1和10个HEK293T细胞生成的LUTHOR文库，测序reads主要比对到到外显子序列。

优异的重现性

创新的THOR扩增技术和强大的文库生成技术两者的结合，不仅提供最灵敏的基因检测，而且具有极好的重现性，即使对单个冷冻后mES细胞也具有超好的重现性(图5)。

图7 |LUTHOR 3' mRNA-Seq具有极好的重复性。A)以10 pg UHRR两个重复样本和B)以两个单独的流式分选的mES细胞样本进行基因检测的相关图，数据量为1 M reads/样本。细胞分选后冷冻，-80℃保存，然后用LUTHOR 3'mRNA-Seq处理。

订购信息：

货号:

143 (LUTHOR 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina)

相关产品:

101 - 104, 156, or 105 (Lexogen UDI 12 nt Sets A1 - A4, or B1)

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LUTHOR-3-mRNA单细胞建库试剂盒说明书