客户文献|宏基因组研究高山抚仙湖完全对流时期的微生物群落分层

近日，合作单位中国科学院南京地理与湖泊研究所于《Limnology and Oceanography》杂志（IF=4.325），发表关于高山富营养抚仙湖温暖完全对流期间的深度剖面的微生物群落组成和功能基因含量研究论文。总体而言，细菌是不同水深下的优势微生物群，而噬菌体在上扬阶段具有较高的相对丰度。

研究背景

温暖湖泊中的次生水对积聚和分解地表产生的有机物很重要，再生的养分将通过冬季垂直混合提供给生水。目前，当湖泊热分层消失时，我们对下层生物中微生物群落的组成和功能了解甚少。

本研究中，抚仙湖被作为模型系统来确定湖水的周期物理性质混合能否模糊上层水温（epilimnetic）和下层滞水带（hypolimnetic）微生物组界限，促进温暖对流期统一的结构和功能的发展。抚仙湖（24 350N，102 500E，1788.5 m a.s.l）位于云贵高原的温暖、贫营养型单循环湖，是中国第三大湖泊（最大深度为158.9 m）。抚仙湖的水量约为206亿立方米，居中国淡水湖之首。据推测在上新世时期（Pliocene age），由地址构造断裂形成的湖泊。

研究设计

1、取样时期：12月抚仙湖完全对流时期。

2、取样方法：水面（0 m）向下至140 m的深度，并在10、20、30、40、50、60、80、100和120 m处采集样品。每个深度的水都通过200 mm尼龙网进行现场过滤，然后储存在25升聚碳酸酯瓶中，直到2-4小时后在实验室进一步处理。实验室将每个深度的600 mL水通过0.2μm聚碳酸酯膜。
3、测序方法：16S rRNA多样性+宏基因组测序+宏基因组Binning。
4、理化性质：沿深度剖面以5 m的间隔记录电导率（Cond）、pH、水温（Temp）和溶解氧（DO）浓度。每个样本检测总磷（TP）、总氮（TN）、溶解有机碳（DOC）、铵（NH4-N）、硝酸盐（NO3-N）、亚硝酸盐（NO2-N）、可溶性磷（PO4-P）和叶绿素a（Chl a）。


研究结果

01 抚仙湖沿深度剖面的环境因子变化


溶解氧（DO）浓度从地表到50 m是均匀的，50 m以下快速下降，其中在100 m深度处DO为1.0 mg L-1（下图a），而在底部则为0.2 mg L-1以下。在这种情况下，我们将50 m定义为完整时期的上层和下层之间的边界。
高浓度的PO4-P，TP和NO3-N，和低浓度的DOC和NH4-N（图2b，c）。根据每对环境因素之间的相关性分析，形成了两组环境因素，其中包括PO4-P，NO3-N，TP和Chla等因素，定义为“深度+ ENV” ；另一组包括DO，DOC，Temp，pH和NH4-N因子，定义为“深度-ENV”。


02 沿湖泊水深度的微生物群落组成

对测序的reads进行注释，细菌（90.4–95.6%），古细菌（1.19–6.50%），真核生物（2.5–4.1%）和噬菌体（0.05–0.47%）（下图a）。细菌占主导，在上下层交界处古细菌更丰富。

（1）细菌
总体而言，门水平上Proteobacteria丰度最高（平均50.68%，44.60-58.17%），其次是Actinobacteria（平均29.37%，21.42-37.51%），Acidobacteria（平均4.67%，3.06– 6.07%），Firmicutes（平均3.90%，2.82–4.87%），Bacteroidetes（平均3.75%，2.77–4.60%）。Class水平上，Actinobacteria含量很高（下图b）。Gammaproteobacteria 的含量沿深度分布增加，与“深度-ENV”因子呈显着负相关。另外，Deltaproteobacteria对TN和NO3-N变异敏感。

（2）古菌
古细菌门水平Thaumarchaeota（平均67.3％）丰度最高，其次是Euryarchaeota（平均26.0％），Candidatus Micrarchaeota（平均6.2％）。仅在20 m的深度处发现了假丝酵母念珠菌，而在湖上层以下的多枝念珠菌含量更高。嗜盐菌的丰度与“深度-ENV”因子呈负相关，而嗜热菌的相对丰度与“深度-ENV”呈相反的趋势（下图c）。

（3）真菌
在用20μm筛网预过滤后，藻类在深度剖面中成为最丰富的真核生物（1.64%，范围1.29–2.26%），其次是真菌（1.17%，范围0.96-1.39%）和Apicomplex（0.20%，范围0.13–0.42%）。 霸王藻类是主要的真核生物，在80 m的深度具有最大的丰度。小于20μm的真核生物与环境波动的相关性较小（下图d）。

（4）噬菌体
完整噬菌体的最大数量出现在20 m的深度处（n = 923），在140 m的深度处减少到203。大多数噬菌体没有明确分类。未培养的Mediterranean噬菌体（例如uvMED，uvDeep和MEDS5）占主导，其次是Synechococcus噬菌体，Methylophilales噬菌体和Cyanophage。


03 微生物群落功能概况
对宏基因组组装数据KEGG注释，我们主要关注不同湖水深度中碳固定，氮和硫循环的途径。
（1）光系统
总体而言，在采样时，光系统I和II的丰度在光合区内20 m处达到峰值（下图a）。此外，光系统I和II的所有蛋白亚基都注释到Synechococcus，这与它们的光合作用有关。球菌被认为是抚仙湖冬季光合作用的主要组成部分。光系统II中的D1蛋白（psbA）和CP47反应中心蛋白（psbB）均是从变形杆菌中鉴定的。

（2）氮循环
从宏基因组中获得了46个基因亚家族，它们靶向氮循环中的8个途径。对于固氨，湖中的直接和间接途径都很多（下图b）。ATP依赖的谷氨酰胺合成酶编码基因glnA是最丰富的氮循环基因，尤其是在60 m以上的深度。gltB和gltD也可以积累，与glnA协同进行间接氨固定。谷氨酸脱氢酶（GDH2和gdhA）沿深度分布显示均匀分布，谷氨酸合酶gltBD相对于NH4-N浓度的同步下降，而gdhA的存在表现出相反的趋势。
在深层水体中，硝酸盐运输、反硝化和硝化等过程会加剧。在氮循环中所有46个基因，narGH，norZ，nrtABC和amoABC的丰度沿深度分布显着增加，此外有11基因与PO4-P浓度呈正相关。

（3）硫循环
水体检测到的所有功能基因都涉及异化硫酸盐还原（DSR）的三个步骤，即硫酸盐转化为磷酸亚磷酸腺苷（APS，sat），将APS还原为亚硫酸盐（aprAB）和还原亚硫酸盐转化成硫化物（dsrAB）与沿深度的PO4-P增长曲线显著相关（下图c）。

04 宏基因组Binning组装抚仙湖水MAGs
宏基因组Binning共获得了1002个MAG。数据检测后发现，440 MAG（104,619个contigs，1203.63 Mb）符合“高质量”标准（完整性≥50％，污染≤10％，重叠群数≤500）。获得的MAGs有10个门，包括Proteobacteria（98），Actinobacteria（93），Planctomycetes（84），Verrucomicrobia（38），Bacteroidetes（34），Nitrospirae（9），Crenarchaeota（9），Euryarchaeota（6），Acidobacteria（4）和Cyanobacteria（1）。
PhyloPhlAN进化树（153 MAG，下图）和古细菌（8 MAG）中显示了161个MAG（完整性≥80％，污染≤10％）。

检测到的细菌菌群在各层之间存在差异分布（下图）。 例如，仅在湖上层中鉴定出一种Synechococcus的蓝细菌MAG，而在湖上层-下层渡区中硝化螺旋菌门更为丰富。嗜酸菌仅积累在下层间缘的中层深度（80-120 m）中，而浮生菌和真鳞藻主要分布在下层。

05 Planctomycetes（浮霉菌门）的多样性
通过系统进化分析研究了84种放线菌MAGs的进化关系和分类学等级。32个MAGs与新近被提名的Nemodlikiaceae（CL500-3）聚在一起，将该族从22个扩大到54个MAGs，其中5个MAG分别出现在新科伏牛科和Nixeaceae中（支持信息图S10）。此外，16个MAGs三个已知的Planctomycetes，Planctomycetacia和Phycisphaerae不同。根据bootstrap值和ANI相似性，提名了一个新类“ Plancto_FXH1”。

06 MAGs的COG分类
MAG的广泛系统发育表现使我们能够比较该生态系统中各分类组之间的功能潜力。在检查COG类别时，只有七个类别显示两组之间没有显着差异，包括“ A RNA加工和修饰”，“ D细胞周期控制，细胞分裂，染色体分区”，“ E氨基酸转运和代谢”，“ G碳水化合物运输和代谢”，“ H辅酶运输和代谢”，“ L复制，重组和修复”和“ V防御机制”。有趣的是，尽管基因组大小有很大差异，所有核心基因组功能仍得以保留。
总结
本文重点研究了完全对流期间湖水垂直混合过程中低层微生物群落的组成和功能。宏基因组Binning获得了440个MAGs，涵盖了迄今为止可用于许多淡水谱系的最大基因组信息，并沿该深度剖面揭示了淡水远洋微生物群落的多样性。我们还从这些MAG定义了新的浮游菌类“ Plancto_FXH1”，其中发现了独特的硝酸盐还原操纵子。
宏基因组学和宏基因组Binning测序技术对于描述与环境变化相关的不同深度微生物群概况非常有用，对于研究生物地球化学循环与其微生物参与者之间的关联非常重要。
【参考文献】
Stratification of microbiomes during the holomictic period of Lake Fuxian, an alpine monomictic lake. Limnology and Oceanography, 2019.


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