多重PCR捕获

        基于AmpliSeqTM的目标区域捕获技术是云生物自主研发的一种针对临床级确定基因热点的超速检测模式，即针对客户感兴趣的目标区域进行快速靶向线性扩增后，使用主流的测序平台Illumina进行大批量样本平行检测与深度分析的整体解决方案。该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大地提高了特定目标区域的研究效率，通过对大量样本目标区域的研究，有助于发现和验证疾病相关候选基因或相关位点，也可以进一步找到候选区域或候选基因内的易感位点，在临床诊断和药物开发方面有着巨大的应用潜力。

技术优势

       1.高信息度：目标基因组区域富集和测序，保证98%以上的覆盖度，确保了易感位点的检测。

       2.节约时间：定制panel耗时短，在线设计高效简便。

       3.节约成本：相比于全基因组重测序、外显子测序和探针捕获测序更加经济。

       4.高通量：满足大量样本多个目标区域的研究。

服务流程

应用方向

标准分析流程

标记扩增深度测序（Tam-Seq）技术检测卵巢癌患者血浆ctDNA

研究概要：

      目前要获得组织或细胞常用的方法有细针吸取、穿刺活检、切取活检、切除活检和手术探查等手段。但是无论是采用何种活检方式，都会对患者机体产生伤害，Tam-Seq检测方法可解决这一局限性。采用Tam-Seq检测方法确定了存在循环DNA样本中癌症等位基因检出突变率可达到2%，该方法的敏感性和特异性高于97%。还确定了晚期卵巢癌患者血浆ctDNA中存在肿瘤抑制基因TP53的突变。使用Tam-Seq方法，可以非侵入性地查明多个原发性肿瘤患者转移复发的源头。这种低成本、高通量的方法，可方便地用于循环DNA的分析，作为个体化癌症基因组学的一种非侵入性的“液体活检”方法。

研究思路：

      （1）对感兴趣的片段进行引物设计--覆盖了TP53的exon 5到6；不同的颜色代表不同的引物对。

       （2）两步扩增

        预扩增：利用特异性引物进行15个循环的目标区域扩增

       标签扩增：利用带barcode的通用接头标签进行二次扩增

研究结果：

        1.组织样本测序结果

      47个卵巢癌患者的ctDNA，设计引物分别扩增TP53、EGFR、BRAF、KRAS等癌症相关基因共5995bp突变区域，测序结果显示所有已知突变均被检出，只有一个假阳性位点，并且还检测到 3个AF = 0.6%的低频位点。而一代测序只能检出突变检出率高于2%的位点。并且还发现了一个新的EGFR突变位点，同时用数字PCR做了验证。

       2.追踪患者的ctDNA

      追踪一个转移性乳腺癌患者16个多月，在其血浆中发现10个伴随的突变。在接受治疗之后突变频率升高。

参考文献      

Forshew,et al.Noninvasive Identification and of Cancer Mutations by Targeted Deep Sequencing of Plasma DNA.Science Translational Medicine.2012 May 30;4(136):136.