《Mol Plant Pathol》发表PrhP调节青枯菌毒力相关转录组研究

近日，合作客户于中科院一区杂志《Molecular Plant Pathology》（IF=4.379）发表青枯雷尔氏菌毒力相关转录组研究。


青枯雷尔氏菌是全世界50个科共450多种植物枯萎病的病原体。酚酸是植物合成的次生代谢产物和生物活性化合物，参与植物细胞壁的结构。青枯雷尔氏菌可代谢两种代表性的酚酸：阿魏酸（FA）和水杨酸（SA），以保护其免受酚酸的毒性。
此次研究从基因上证明了一种新颖的酚酸脱羧酶（PadR）-调节剂PrhP，可作为青枯雷尔氏菌中SA和FA解毒的积极调节剂。


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研究设计


1、研究对象：青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）；
2、突变体构建：基于pK18mobsacB的同源重组产生产生了prhP突变体（RQ5649）；
3、菌株性质检测：启动子活性测定、β-半乳糖苷酶测定、毒力测定、超敏反应（HR）测试以及细菌生长曲线测定；
4、高通量测序：青枯菌在hrp诱导培养基中生长至OD600约为0.1，提取RNA，Illumina HiSeq平台测序；
5、qRT-PCR验证。


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研究结果


PrhP降解SA和FA的能力增强了青枯菌对宿主植物的感染过程，还极大地促进了感染过程。研究从生长测定，启动子活性测定，RNA-seq和qRT-PCR得出的结果表明，PrhP在青枯菌的毒力中起多种作用：
1、PrhP积极调节SA和FA降解基因的表达
选择培养基表明，prhP突变体（RQC607）比野生型菌株对SA和FA的敏感性高得多。PadR调节剂通常在不存在酚酸的情况下与PADse基因的启动子结合以抑制其表达。补充SA后，大大增强了RQC607中的nag表达。SA存在情况下，在营养限制培养基中prhP缺失会显著降低nag的表达，但在营养丰富的培养基中则没有改变。


2、PrhP在体外和植物中均积极调节T3SS表达
最初通过转座子诱变将PrhP筛选为T3SS调节候选基因，其中构建popA-lacZYA融合体以监测青枯菌中T3SS表达。青枯菌具有很大的异质性，即使在同一宿主中，不同的菌株通常也表现出不同的表型。本文从GF0001生成了prhP突变体（GF0018），以确定PrhP是否在不同的青枯菌菌株中调节T3SS表达。prhP突变体（GF0018）中popA表达明显受损，并且互补的PrhPOE1-1将GF0018中降低的popA表达完全恢复（下图），证实OE1-1的PrhP在功能上与GMI1000相同，并且PrhP对T3SS的调控在不同的青枯菌中也得到了保留。

与hrp诱导培养基相比，植物中的T3SS表达可以提高到更高的水平。研究从番茄茎和烟草叶中回收了细菌细胞，以确定在植物中T3SS表达是否需要PrhP。植物实验结果证实，PrhP在体外和在植物中均正调控T3SS表达（下图）。

3、PrhP可大大促进青枯菌的感染过程
T3SS对于青枯菌的致病性至关重要，降解SA和FA的能力可以促进其对宿主植物的感染过程。植物实验证实，PrhP是青枯菌向宿主植物的感染过程所必需的，可以极大地促进番茄的感染过程。
在青枯菌中，T3SS和T3E由关键调控因子HrpB直接控制，HrpG和PrhG的两个紧密旁系以平行方式正向调控hrpB的表达。T3SS上PrhP的调控是由关键调控因子HrpB新途径介导的。
prhP突变体（GF0018）在烟叶中表现出与GF0001类似的坏死病灶，表明PrhP对于烟叶中GMI1000的超敏反应（HR）诱导不是必需的。

4、PrhP对于青枯菌的植物生长很重要
植物界中的广泛增殖是青枯菌中最重要的致病性决定因素之一，那么青枯菌在植物体内的生长是否因prhP缺失而改变？研究进行了番茄、烟草接种青枯菌实验，与野生型菌株（RK5050）相比，prhP突变体（RQ5649）在番茄茎杆中的生长受到了明显的损害。烟草植株对SA的表现出与番茄植株不同的SA代谢活性，prhP突变体的生长在烟叶中也显着受损，但这比野生型菌株少约一到两个数量级。所有植物实验证实，不管宿主植物是什么种类，PrhP对于青枯菌在植物内生长都很重要。
5、PrhP调节大量毒力相关基因的表达
青枯菌整合了多种毒力因子以发展对宿主植物的感染过程，包括鞭毛、IV型菌毛、EPS和CWDE。研究通过RNA-Seq分析以明确青枯菌在致病性中的多种作用。转录组分析显示，野生型菌株（RK5050）和prhP突变体（RQ5649）之间共有698个基因差异表达了2倍以上，其中20个和678个基因被上调和下调（下图）。
与启动子活性测定的上述结果一致，在prhP突变体中，nagAa基因的表达水平显着下调了4.76倍（下图）。prhP突变体中的hrpB表达确实显着下调了15.03倍，hrp基因簇包含大约20个基因，其中12个基因的表达水平在prhP突变体中显著下调。此外，HrpB直接控制着大量T3E的表达，并且大多数的T3E的表达在prhP突变体中均显著下调（下图），这与qRT-PCR的上述结果一致。
此外，在prhP突变体中，编码鞭毛大部分成分的许多基因的表达显着下调（下图f），表明鞭毛组装因prhP缺失而受损。研究评估了PrhP对游泳运动的影响，与转录组结果一致。已知许多与IV型菌毛相关的基因的表达被prhP缺失显着下调（下图e），这些基因对于根系附着和抽动运动很重要，并有助于致病性。所有这些结果证实，PrhP调控大量毒力相关基因的表达，并促进青枯菌向宿主植物的感染过程。


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总结



本研究通过青枯菌生长测定、启动子测定、RNA-seq和qRT-PCR得出的结果表明，新型PadR调节剂PrhP在涉及青枯菌感染的多个过程（例如排毒）中起着重要的调节作用。PrhP影响酚酸的表达，在宿主植物中的广泛增殖以及大量与毒力相关的基因的表达。T3SS是许多致病细菌中必不可少的致病性决定因素之一，PrhP通过关键调控因子HrpB介导但通过一些新途径来正向调节其表达。这是有关调节T3SS的PadR调节剂的首次研究报道，研究结果增进了我们对青枯菌中PadR调节剂的各种生物学功能和T3SS上复杂的调节途径的了解。

【参考文献】
Involvement of a PadR regulator PrhP on virulence of Ralstonia solanacearum by controlling detoxification of phenolic acids and type III secretion system. Molecular Plant Pathology, 2019


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