蛋白提取裂解方法

1.细胞样品

融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

1.1贴壁细胞

除去培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液清洗一遍（如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗）。按照6孔板每孔加入100-200ul（6cm培养皿200-300ul）裂解液的比例加入裂解液。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。

1.2悬浮细胞

离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散，按照6孔板每孔细胞加入100-200ul裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必须分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

在冰上充分裂解20-30min后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100ul裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150-200ul。

2.组织样品

a）把组织剪切成细小的碎片；

b）融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

c）按照每20mg组织加入100-200ul裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可是适当减少裂解液的用量。）

d）用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

e）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

f）如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分，然后同样离心取上清。