RNA质量鉴定方法，你知道几种？

众所周知，RNA质量包括完整度和纯度两个方面。

大家知道，低纯度的RNA会严重影响下游的RT-PCR和RT-qPCR反应，特别是RT-qPCR。

如果RNA中含有一些酚类等小分子化合物则会抑制下游的RT-PCR反应；

如果RNA受到DNA等基因组的污染，则会影响qPCR实验数据。

对RNA完整度和纯度进行鉴定，通常我们会通过电泳和OD值的测定。RNA电泳是评估RNA完整性最常用、最简单快速的方法。

RNA电泳

1）完整的RNA通常会有三条带，有的也会两条带（有些试剂盒提取的时候会过滤掉5S条带）

2）最亮的条带为28S条带，其次为18S条带，最淡条带为5S条带；28S条带亮度应为18S条带亮度的2倍左右。

通常在我们得到的电泳结果也会出现多种异常现象，比如：

RNA条带降解

降解可能出现在提取过程或电泳过程。建议：

1）在RNA提取过程中，应严格操作，全程避免RNA酶的污染，同时保证组织材料的新鲜。

2）在电泳时，应换用新鲜的电泳液，新制备的凝胶，同时应较高电压短时间电泳（20 min）。

RNA条带弥散

出现条带弥散的原因：RNA被核酸酶降解；电压或电流过大；上样量过高或过低等。建议：

1）应避免上述RNA降解出现的问题。

2）控制电压勿过高或过低，一般5—8 V/cm即可；避免电泳时间过长。在电泳开始的前几分钟建议使用低电压。

点样孔发亮

a：RNA样品的污染（含有杂质，如蛋白的残留，可能的原因为RNA提取过程中的操作问题：如氯仿加入量过少，不能充分变性蛋白；氯仿加入量过多，使DNA和蛋白进入水相，影响RNA的提取质量）。

b：胶的问题：如未能凝固好，RNA样品无法很好的往前涌动，同时上样量可能过大。

电泳结果多条带

1）RNA降解（解析见上文）。

2）上样量过大（RNA种类较多，过大上样量会出现除rRNA之外的条带）。

看完RNA电泳，再看看OD值测定

OD值测定

对于核酸分子来讲，因含有嘌呤和嘧啶，他们有共轭双键，在260 nm处有最大吸收峰，故核酸的吸收峰在260 nm处。氨基酸中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含共轭体系，在280 nm处有吸收峰，大多数的蛋白质中均含有这些氨基酸，因而蛋白质在280 nm处有最大吸收峰。

通常情况下一些盐离子和小分子化合物在230 nm处有吸收峰。

提取之后经过适当纯化、纯度较高的RNA样品，OD260/280在1.9-2.0之间，较纯净的RNA样品OD260/280比值大于2。

核酸提取的过程中，许多试剂都会影响OD260和OD280的读数。

有研究表明，少量异硫氰酸胍的残留会使A230变大，但A260、A280几乎不变。所以A260/A280仍在2.0左右，而A260/A230远低于2.0。

大量异硫氰酸胍的残留会使A230、A260、A280均变大，对于比值的影响无法推测。

PEG残留则会使A230、A260、A280均变大，但对A230和A260影响更大，故使得A260/A280远大于2.0，而A260/A230仍在2.0左右。