JIPB |丹参中丹参酮类成分细胞外排的分子机制

2024年11月22日，Journal of Integrative Plant Biology （JIPB）期刊发表了上海中医药大学肖莹课题组题为'The ABC transporter SmABCG1 mediates tanshinones export from the peridermic cells of Salvia miltiorrhiza root'的研究论文，阐述了ABC转运体SmABCG1介导丹参酮从丹参根部表皮细胞外排，为植物二萜转运提供了新的视角，并为代谢工程和合成生物学研究提供了一种新的遗传工具。

植物产生多种代谢物以适应环境，其中萜类化合物对生长和抗逆性至关重要。尽管萜类生物合成途径已有所研究，但其运输机制尚不明朗。丹参作为研究二萜生物合成的模式植物，引起人们极大地兴趣。丹参根部的丹参酮是以广泛共轭结构为特征，这一特征使根呈红色。ABC转运蛋白对萜类运输至关重要，由两个核苷酸结合结构域（NBD）和两个跨膜结构域（TMD）组成，使其能够独立执行运输功能。NBD在ABC蛋白中高度保守，而TMD则表现出变异，能够运输各种底物。在本篇文章中，作者发现丹参酮可通过皮周细胞运输，且SmABCG1参与其外排并可能影响生物合成。丹参酮ⅡA对拟南芥根系有毒性。这些发现为植物二萜的运输和生理作用提供了新见解。

1.丹参酮从丹参根的外胚层外排，进一步进入根际土壤

作者监测了丹参幼苗根部形态变化，发现丹参酮在丹参根的周皮中特异性合成，在发芽后大约25天（DAG）时，丹参酮的积累变得明显，表明丹参酮的初始生物合成。在大约35 DAG时，观察到丹参酮在表皮细胞的细胞间隙内明显积聚。随后作者通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱对丹参的根际土壤进行分析，鉴定出6个丹参酮，其中，丹参酮ⅡA和隐丹参酮在土壤中的丰度最高。这些结果表明，丹参酮通过未鉴定的转运蛋白从皮周细胞分泌到邻近的土壤中。

图1 丹参根周皮细胞层中红色丹参酮的输出和分泌到根际土壤中

2.SmABCG1是丹参中潜在的丹参酮转运蛋白

ABC转运蛋白家族促进二萜转运，我们推测丹参酮也依赖此机制。丹参中有126个ABC转运蛋白基因，ABCG亚家族最大。通过分析27个丹参根转录组（九个时期，每个时期三个生物重复），样本被分为两类：0-20DAG和25-40DAG，ABC基因被分为6簇，其中集群1与丹参酮积累模式一致。我们构建了丹参酮与ABC基因的相关网络，发现17个ABC基因与丹参酮正相关，包括集群1中的16个。系统发育树显示SmABCG1与二萜转运蛋白最接近，且与丹参酮ⅡA和丹参酮Ⅰ显著正相关。SmABCG1位于丹参基因组6号染色体，与萜类BGC相邻，支持其转运作用。进一步研究发现，SmABCG1在根周皮中转录水平最高，与丹参酮生物合成和积累部位一致。综上，SmABCG1参与丹参酮转运。

图2 与丹参酮外排相关的ABC转运蛋白的鉴定

3. SmABCG1在丹参中的表达模式

作者利用携带SmABCG1启动子驱动的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因的转基因丹参以及对SmABCG1 进行亚细胞定位，结果显示，SmABCG1是一种典型的质膜转运蛋白，其编码基因在表皮细胞中选择性表达，支持其在丹参酮转运中的作用。

图3 SmABCG1的表达分析

4. SmABCG1的体外功能研究

我们利用非洲爪蟾卵母细胞系统研究SmABCG1功能。通过注射cRNA异种表达SmABCG1，并确认其成功表达于质膜上。为探究转运功能，我们向卵母细胞注射多种丹参酮，并测定残留量。结果显示，表达SmABCG1的细胞中丹参酮IIA和丹参酮I含量显著降低，表明SmABCG1对它们具有选择性转运活性；使用钒酸盐作为抑制剂进一步验证，发现SmABCG1对这两种丹参酮的转运能力被降低，进一步证明SmABCG1参与丹参酮的出口。

图4 SmABCG1的体外功能研究

5.丹参毛状根中SmABCG1的功能研究

我们利用CRISPR/Cas9技术构建了SmABCG1编辑的丹参毛状根突变体，通过测序显示，毛状根系中的所有突变仅发生在单导向RNA（sgRNA）靶位点，由1个碱基插入组成。通过测量突变体和培养基中的丹参酮水平，发现SmABCG1功能缺失导致丹参酮含量显著降低。同时，生成SmABCG1过表达的毛状根，发现丹参酮水平显著增加。此外，SmABCG1的表达变化还影响了CYP76AH3的转录水平，暗示SmABCG1可能间接调节丹参酮的生物合成。结合体外实验，我们推测SmABCG1具有底物多特异性的丹参酮输出功能。

图5 丹参毛状根中SmABCG1的功能研究

6.三维建模揭示了SmABCG1和丹参酮ⅡA的潜在结构相互作用

SmABCG1编码由1428个氨基酸组成的蛋白质。为了阐明外排机制，作者重建了不同配体状态下SmABCG1的结构模型，在SmABCG1的内向构象中，由TMD形成的底物进入通道向细胞质侧开放，从而促进外排底物的接收。当构象变为外向状态时，TMD基序在细胞外侧打开一个出口通道，使底物释放到细胞外空间。并且向外模式的自由能相比于向内模式低了30.7 kJ/mol，这些发现表明，当从面向内的构象转变为面向外的构象时，SmABCG1与丹参酮ⅡA的结合亲和力降低，支持SmABCG1作为丹参酮ⅡA输出者的作用。

图6 SmABCG1的预测结构模型及其与丹参酮ⅡA的潜在相互作用

7. 丹参酮IIA对拟南芥根系具有细胞毒性

作者使用各种丹参酮化合物处理拟南芥幼苗，结果发现，丹参酮IIA、二氢丹参酮I和隐丹参酮对拟南芥根部表现出生长抑制作用，然而，当在培养基中加入丹参酮I时，没有观察到差异。为研究该现象的机制，进行了转录谱分析以及探究生物学术语，结果发现，丹参酮IIA处理引起的拟南芥根中的显著转录变异；DEGs在毒素代谢过程、毒素分解代谢过程、对有毒物质的反应、细胞死亡、免疫系统过程、植物型超敏反应等显著富集。这些发现表明丹参酮ⅡA具有细胞毒性。在拟南芥过表达SmABCG1，没有减弱细胞毒性，且表现出萼片和雄蕊的矮化和变质发育。这表明SmABCG1与拟南芥中的ABC家族基因有很大不同。

图7 丹参酮ⅡA抑制拟南芥根系生长

综上所述，在这项研究中，作者探讨了丹参酮从丹参根皮周细胞中的流出。作者提出SmABCG1介导了丹参酮ⅡA和丹参酮Ⅰ从皮周细胞的分泌，并且丹参酮ⅡA在拟南芥中显示出潜在的细胞毒性。