Single-cell transcriptomics reveals regulators underlying immune cell diversity and immune subtypes associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma20.507Cell Res . 2020 Jul 20. doi: 10.1038/s41422-020-0374-x. Online ahead of print.
Abstract
Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is an aggressive malignancy with extremely skewed ethnic and geographic distributions. Increasing evidence indicates that targeting the tumor microenvironment (TME) represents a promising therapeutic approach in NPC, highlighting an urgent need to deepen the understanding of the complex NPC TME. Here, we generated single-cell transcriptome profiles for 7581 malignant cells and 40,285 immune cells from fifteen primary NPC tumors and one normal sample. We revealed malignant signatures capturing intratumoral transcriptional heterogeneity and predicting aggressiveness of malignant cells. Diverse immune cell subtypes were identified, including novel subtypes such as CLEC9A+ dendritic cells (DCs). We further revealed transcriptional regulators underlying immune cell diversity, and cell–cell interaction analyses highlighted promising immunotherapeutic targets in NPC. Moreover, we established the immune subtype-specific signatures, and demonstrated that the signatures of macrophages, plasmacytoid dendritic cells (pDCs), CLEC9A+ DCs, natural killer (NK) cells, and plasma cells were significantly associated with improved survival outcomes in NPC. Taken together, our findings represent a unique resource providing in-depth insights into the cellular heterogeneity of NPC TME and highlight potential biomarkers for anticancer treatment and risk stratification, laying a new foundation for precision therapies in NPC.
介绍一篇2020年7月20日发表于Cell Research的文献，题目为“Single-cell transcriptomics reveals regulators underlying immune cell diversity and immune subtypes associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma”，作者从15例原发性鼻咽癌肿瘤（NPC）和1个正常样品中捕获了7581个恶性细胞和40,285个免疫细胞的单细胞转录组谱，揭示了肿瘤内的转录异质性并预测了恶性细胞的侵袭性。作者进一步揭示了免疫细胞潜在的转录调控因子，并且揭示了细胞间相互作用，为NPC的精确疗法奠定了新的基础。此外，作者建立了免疫细胞亚型特异性的转录组特征，并证明巨噬细胞，浆细胞样树突状细胞（pDC），CLEC9A + DC，自然杀伤（NK）细胞和浆细胞与NPC生存改善显着相关。
研究背景
（1）鼻咽癌（NPC）是头颈癌的独特亚型，地域分布极为不均衡。在病因上，NPC与EB病毒感染高度相关，在病理学上发现肿瘤周围和内部免疫细胞大量浸润；（2）虽然免疫检查点抑制剂的免疫治疗已在鼻咽癌患者中取得了不错的临床受益。但是，鼻咽癌患者对于抗PD-1疗法的反应率只有20％–30％ ，说明需要加深对NPC中TME的了解以识别治疗靶点和可靠的生物标记物；研究方案
样本：15名鼻咽癌的患者+1名正常鼻咽上皮组织（图1a）
测序方法：10× Genomics +whole-exome sequencing (WES) +bulk RNA-seq测序数据分析介绍
1.工具：Chromium Single Cell 3′ Library and Gel Bead Kit v2；2.筛选：过滤去除基因数小于201或大于 9000的细胞，并去除线粒体基因组UMI大于20%的细胞3.降维，聚类：Seurat R package (version 3.0.2) ,K 参数为30；4.定义细胞类型：上皮细胞(EPCAM、KRT19、KRT18、 KRT5、 KRT15), 髓样细胞(LYZ、CD68、**MS4A6A、CD1E、IL3RA、LAMP3), T细胞 (CD2 、CD3D/E/G), B细胞 (CD79A/B、CD19、 MS4A1), 成纤维细胞 (COL1A1、COL3A1、 和DCN)；6.CNV分析：inferCNV (version 0.1)；7.伪时序分析：Monocle 2 (version 2.6.4) ；8.通路富集分析：GSVA package (version 1.26.0) ；9.转录调控分析：pySCENIC package (version 0.9.9) ；10.细胞互作：CellPhoneDB Python package (1.1.0) ；结果分析
（1）鼻咽癌微环境单细胞图谱及细胞分型。作者对15个鼻咽癌组织样本和1个正常的鼻咽上皮组织进行单细胞转录组测序，共获得48,584个细胞，根据细胞类型分型，可以分为免疫细胞（如髓系细胞，T/NK，B细胞）,肿瘤相关成纤维细胞（CAF），上皮细胞（恶性细胞和非恶性细胞）。作者在上皮细胞中推断染色体拷贝数变异（CNVs），最终作者从11个肿瘤样本中发现了7581个恶性细胞（图1c）。然后作者对不同的细胞大类进行细分，揭示了一个复杂的肿瘤微环境，包括13个恶性细胞亚群和23个不同的免疫细胞亚群。与肿瘤上皮巢相比，免疫细胞在肿瘤基质中更多富集，特别是对于CD20 + B细胞，CD57 + NK细胞和IL3RA +浆细胞样树突状细胞（pDC）。值得注意的是，肿瘤上皮巢中CD8 + T细胞的浸润相对高于其他免疫细胞类型，表明肿瘤内不同免疫细胞亚型的空间异质性（图1d-e）。而成纤维细胞和内皮细胞几乎在单细胞数据中未发现，反映了单细胞解离方面存在一定的效率差异。
图 1 用scRNA-seq解剖NPC中的肿瘤微环境
（2）识别反映恶性细胞肿瘤内转录异质性的特征。恶性细胞的聚类分群显示出肿瘤间异质性（图2a）。在不同样本肿瘤间的差异基因反映了肿瘤样本间的表型多样性，并发现了44个在不同肿瘤细胞亚群中均表达的元基因（图2b），进行相关基因表达分析后可以分为5个恶性基因表达特征（图2c）。三个上皮分化相关特征主要由上皮基因组成，例如细胞角蛋白（例如KRT6）和富含脯氨酸的蛋白（例如SPRR2和SPRR3）。第四个特征与细胞循环有关，由细胞循环相关基因组成，最后一个特征富集与细胞分泌相关的基因（图2d）。
（3）恶性特征与肿瘤生存率的相关性分析。作者分析了两个独立队列的恶性特征与临床病理特征之间的相关性，包括NPC队列A（n = 113）和NPC队列B (n = 128)。在EBV阳性肿瘤中观察到的Epi-differ 2得分明显高于在EBV阴性肿瘤中的得分（图2e），并与病毒进入宿主细胞有关的基因（即TMPRSS2，PVRL4，CTSB和SLC20A2）高度相关，表明它们通过调节NPC中的EBV感染在促进上皮分化中发挥作用。基质肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）与细胞分泌信号呈正相关（图2f），表明细胞分泌信号的高表达可能促进了NPC中淋巴细胞向TME的募集。此外，生存分析表明，高细胞周期得分与NPC队列A的较差生存率密切相关（图2g，h）， 并在NPC队列B中得到证实。
（4）NPC单核细胞-巨噬细胞分化的新型髓样细胞亚型和调控因子。参与干扰素（IFN）-α和IFN-γ反应的通路在巨噬细胞中上调，而血管生成，NF-κB介导的TNF-α信号传导和缺氧相关通路在单核细胞中被上调（图3d）。这些结果表明，NPC中单核细胞可能具有促进肿瘤的特点，与S100A8和S100A9的高表达相一致（图3c）。然后，作者应用SCENIC分析转录因子（TFs）的表达差异，并确定了在NPC中不同髓样细胞亚型的TF（图3e）。有趣的是，巨噬细胞和单核细胞在许多TF上具有相似的表达模式（图3e），这表明巨噬细胞可能源自募集到NPC TME的单核细胞。BACH1和RUNX1调控的基因的表达在单核细胞中特异性表达，而NR1H3和TFEC的表达在巨噬细胞中很明显（图3e）。并且作者通过siRNA干扰技术发现NR1H3和TFEC促进单核细胞衍生的巨噬细胞的分化和成熟，表明这些调控因子可能促进NPC的抗肿瘤免疫力。有趣的是，进一步的生存分析揭示了NR1H3和TFEC的高表达水平与NPC患者预后改善之间存在关联（图3k，n）。
（4）在T/NK细胞（n = 17,741）细胞中可以分为10个亚群（图4a，b），在CD8+ T-1中高表达细胞因子和效应分子（图4c），表明CD8+ T-1亚群主要的细胞毒性。CD4 + Tconv-2代表幼稚的T细胞，而耗竭性标记基因如PDCD1和TIGIT在CD4 + Tconv-3中高度表达（图4c）。并且作者发现耗竭性的标记基因与细胞毒性标记物的表达高度相关（图4c），这是因为LAG3和HAVCR2与T细胞活性相关，并通过颗粒酶（GZMA，GZMB和GZMH）的平均表达进行定量（图4h）。同样在进行SCENIC分析中，NK细胞与具有细胞毒性CD8 + T细胞的部分TF（例如EOMES，RUNX3和XBP1）均上调（图4i），并且作者通过siRNA干扰技术对其结果进行验证（图4j–l）。
（6）NPC TME中的复杂细胞间通信网络。作者通过CellPhoneDB对配受之间的相互作用进行预测，发现在免疫细胞和肿瘤细胞间的广泛互作（图6a，b）。肿瘤细胞表达较高水平的趋化因子（例如CCL20，CCL19和CXCL10），而相应的受体在免疫细胞中广泛表达，表明这些趋化因子在增强免疫细胞向NPC肿瘤组织的浸润中起重要作用（图6c）。作者也观察到肿瘤细胞和T细胞之间的抑制性相互作用。除CD274-PDCD1外，还鉴定了在NPC中很少报道的其他受体-配体对（例如NECTIN1-CD96，NECTIN2-TIGIT，PVR-CD96和LGALS9-HAVCR2）（图6c，d）。MHC-II主要负责功能失调的T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用所诱导的LAG-3的抑制功能。作者还确定了肿瘤细胞与巨噬细胞之间的配受对，例如CD47–SIRPA和CSF1–CSF1R产生的抑制性或刺激性相互作用（图6c，e）。在巨噬细胞，DC1，DC2和DC3中，尤其是在巨噬细胞和DC3中，检测到趋化因子高表达，表明它们在募集各种类型的免疫细胞中起重要作用（图6f）。有趣的是，DC3和T细胞之间的抑制性交流也很普遍（图6f）。
图 6 NPC TME中的配受结合网络分析
（7）免疫细胞与临床病理特征及生存率的关系。5种免疫细胞（即pDC，DC1，NK细胞以及FCRL4 +和血浆B细胞）与EBV感染相关，与EBV阴性肿瘤相比，所有这些免疫特征在EBV阳性肿瘤中的得分均显着降低（图7a）。CLEC9A + DC1与EBV DNA水平呈显着负相关（r =-0.38; P <0.001），表明DC1可能受EBV主动复制的影响（图7b）。尽管DC1，FCRL4 + B，GC B和浆细胞与较高数量的突变显着相关，但是大多数免疫细胞亚型通常与突变负荷相关性较弱（图7c）。最后，在NPC队列A中，生存率与巨噬细胞，pDC，DC1，NK细胞和浆细胞的特征之间存在显着的正相关（图7d，e），并在NPC队列B中得到验证。单细胞图谱分析
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