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——‍SubtypeGSEA代码‍

GSEA全名为Gene SetEnrichment Analysis（基因集富集分析）。用以分析特定基因集（如关注的GO条目或KEGGPathway）在两个生物学状态（如癌症与对照，高龄与低龄）中是否存在差异。能够研究基因变化的生物学意义。

SubtypeGSEA是在GSEA的基础上对不同亚型样本中重要通路的富集情况进行组间比较，能直观比较不同亚型中相同通路富集情况。

基本原理

GSEA主要分为基因集进行排序、计算富集分数（Enrichment Score，ES）、估计富集分数的显著性水平并进行多重假设检验三个步骤。

第一步对输入的所有基因集L进行排序，通常来说初始输入的基因数据为表达矩阵，排序的过程相当于特定两组中（case-control、upper-lower等等）基因差异表达分析的过程。根据所有基因在两组样本的差异度量不同（共有六种差异度量，默认是signal 2 noise，GSEA官网有提供公式，也可以选择较为普遍的foldchange)，对基因进行排序，并且Z-score标准化。

第二步是GSEA的核心步骤，通过分析预先定义基因集S在第一步获得的基因序列上的分布计算富集指数Enrichment Score，并绘制分布趋势图Enrichment plot。每个基因在基因集S的EnrichmentScore取决于这个基因是否属于基因集S及其差异度量（如foldchange）。差异度量越大基因的EnrichmentScore权重越大，如果基因在基因集S中则Enrichment Score取正，反则取负。将基因集L在基因集S里的所有基因的Enrichment Score一个个加起来，就是Enrichment plot上的Enrichment Score趋势，直到Enrichment Score达到最大值，就是基因集S最终的EnrichmentScore。

第三步是为了检验第二部获得结果的统计学意义，对Enrichment Score进行标准化，计算标准化Enrichment Score（NES）。并计算显著性水平（NOMp-val）和矫正多重假设检验显著性水平（FDR q-val）。

SubtypeGSEA则进一步整合不同亚型样本富集到的关键基因集S的GSEA富集分数，绘制热图进行比较性展示。

数据要求

1、通常为表达谱芯片或测序数据（已经过预处理），也可以是其他形式可排序的基因数据。

2、具有已知生物学意义（GO、Pathway、癌症特征基因集等）的基因集。

3、样本对应亚型数据

下游分析

得到GSEA结果之后的分析有：

1.   不同亚型生存分析

2.不同亚型GSVA分析和量化的差异比较

图形示例：

1、三个亚型中上调Top基因集的富集度比较

图注：

图中热横坐标的3列对应3个亚型（分组），最左侧色条的背景色对应3个亚组（分组）富集的上调前10基因集。

2、三个亚型中下调Top基因集的富集度比较

图注：

图中热横坐标的3列对应3个亚型（分组），最左侧色条的背景色对应3个亚组（分组）富集的下调前10基因集。

应用示例：

文献1：Gene expression profiling of 1200 pancreatic ductal adenocarcinoma reveals novelsubtypes.（于2018年5月发表在BMC　cancer，影响因子2.933）

基于1200个胰腺导管腺癌的基因表达数据划分新的分子亚型

为了分析胰腺导管腺癌的异质性，作者分析了1200个患者的基因表达数据，并最终将患者分为6种亚型。文中使用SubtypeGSEA比较了这6种亚型患者表达数据GSEA结果的差异。

文献2：Head and neckcancer subtypes with biological and clinical relevance: Meta-analysis ofgene-expression data（于2015年4月发表于Oncotarget.，影响因子5.008）

头颈瘤中根据生物学意义和临床特性划分亚型：基因表达数据的meta分析

为了更好的对头颈瘤患者分层并进行针对性治疗，作者基于大量头颈瘤样本进行meta分析，并划分出与预后相关的六个亚型。文中绘制SubtypeGSEA展示了不同亚型中富集分子途径和癌症特征的差异。