ELISA+Array=磷酸化研究 So Easy！

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磷酸化蛋白研究 So Easy！





蛋白磷酸化



    蛋白质磷酸化是研究最多的翻译后修饰 (PTM)，其中来自三磷酸腺苷 (ATP) 的磷酸基团共价连接到丝氨酸 (~86%)、苏氨酸 (~12%) 或酪氨酸 (~2 %) 被激酶去除并被磷酸酶去除。磷酸化可以改变蛋白质的结构、功能和相互作用。因此，磷酸化在体内平衡和疾病的几乎所有细胞过程中都起着至关重要的作用，包括信号转导、细胞周期、分化、增殖、新陈代谢、运动和死亡。重要的是，不同残基的磷酸化会导致不同的结果。例如，RAF1 是 MAPK 通路的核心激酶，当它在丝氨酸 (S) 或苏氨酸 (T) 残基 S259、S338、S340/341、T491 或 S494 处被磷酸化时会被激活。然而，S289/296/301 的磷酸化会导致 RAF1 激酶活性的抑制。了解磷酸化的特定位点和水平对于了解细胞信号传导和表型至关重要。

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    常用研究蛋白磷酸化的方法有SDS-PAG与Western blotting，本文将提供ELISA、抗体芯片方法介绍；




SDS-PAGE



    样品中的蛋白质（通常是细胞或组织裂解物）首先使用 SDS-PAGE 按大小进行分离，然后可以用考马斯蓝或银染色观察蛋白质， 这种方法的一个明显缺点是无法消除由于其他因素（例如糖基化）引起的迁移变化。还可以在激酶反应过程中使用放射性标记的 ATP，然后通过其掺入的放射性标记的 ATP 用放射自显影、荧光照相或荧光成像来检测磷酸化的蛋白质。


特点：

  • 实验难度低

  • 无需特殊实验室设备

  • 不依赖抗体

  • 放射性标记的 ATP：健康危害；需要放射自显影、荧光照相或荧光成像

  • 考马斯亮蓝或银染：无法消除由于其他因素（例如糖基化）引起的迁移变化

  • 无法确定特定的磷酸化位点




Western blotting



    Western blotting是定性测量磷酸化水平的金标准。通过 SDS-PAGE 分离蛋白质后，进行转膜，孵育抗体，添加 HRP 底物，从而产生化学发光。Western blotting的敏感性和特异性取决于所使用的抗体，如果抗体与样品中的其他蛋白质非特异性结合，将会影响结果的判读。

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特点：

  • 化学发光成像仪即可

  • 可以识别特定的磷酸化位点

  • 操作较SDS-PAGE复杂，传统上需要 1~2 天

  • 不适合大样本量的实验




ELISA



    传统的基于夹心的 ELISA 使用两种抗体来检测感兴趣的蛋白质，用 ELISA 检测磷酸化蛋白，一种抗体结合总蛋白，而另一种结合磷酸化位点；

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   下图为Western blotting和 ELISA 数据的比较， 结果相似，且基于96孔板的 ELISA 可以一次检测更多样本。

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特点：

  • 使用酶标仪读取数据，无需特殊仪器

  • 更简单的操作，一天内完成实验

  • 可以识别特定的磷酸化位点

  • 基于96孔板的 ELISA 可以一次检测更多样本

  • 一个试剂盒可简单完整磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白检测

    RayBiotech磷酸化ELISA系列，提供快速、灵敏、简单的方法进行蛋白磷酸化研究，无需传统配胶-跑胶-转膜等繁杂工作，做到蛋白磷酸化研究，几个样本快速，一批样本省心。


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References




抗体芯片



    通过使用基于夹心的抗体芯片可以对磷酸化蛋白进行多重检测，操作与磷酸化ELISA相似,Western blotting、ELISA 和抗体芯片数据之间的比较表明，当 NIH3T3 细胞用 PDGFβ 处理时，所有三种方法都反映了相似的磷酸化变化。


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特点：

  • 高通量磷酸化蛋白检测

  • 膜芯片使用化学发光成像仪，无需特殊设备

  • 多种信号通路抗体芯片可供选择

  • 操作简单，最快1天完成多样本，多蛋白检测


RayBiotech磷酸化芯片，基于双抗体夹心法，操作与磷酸化ELISA相似，并在此基础上拥有节省样本，多靶标，多位点，多通路研究的优势！


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AAH-NFKB-1-2（11个因子）

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AAH-TGFB-1-2（8个因子）

•Multi-PathwayPhosphorylationArray: MAPK, AKT, JAK/STAT, NFkB,& TGFb

AAH-PPP-1-2(55个因子）


References

  • Zhang, Dan, et al. "MALAT1 is involved in the pathophysiological process of PCOS by modulating TGF? signaling in granulosa cells." Molecular and cellular endocrinology 499 (2020): 110589.

  • Zhang D, Tang HY, Tan L, Zhao DM. MALAT1 is involved in the pathophysiological process of PCOS by modulating TGF? signaling in granulosa cells. Mol Cell Endocrinol. 2020 Jan 1;499:110589.

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  • Smolensky D, Rhodes D, McVey DS, et al. High-Polyphenol Sorghum Bran Extract Inhibits Cancer Cell Growth Through ROS Induction, Cell Cycle Arrest, and Apoptosis. J Med Food. 2018;21(10):990-998.

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