MLF1的表观遗传失调通过EGFR/AKT和Wnt/β-catenin信号通路驱动肝内胆管癌的进展

研究背景
肝内胆管癌(iCCA)是一种高侵袭性的恶性肿瘤，预后极差。近年来，肝内胆管癌的发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势。由于缺乏适合早期诊断的肿瘤特异性生物标志物，大多数肝内胆管癌患者通常在晚期才被诊断，目前可用的系统治疗效果非常有限。

髓细胞性白血病蛋白1 (MLF1)是一种由t(3;5)(q25.1;q34)染色体易位产生的NPM-MLF1融合蛋白。MLF1在骨髓增生异常综合征、肺腺癌、甲状腺癌和神经母细胞瘤中异常表达。它可以促进肿瘤细胞的生长和增殖，抑制细胞凋亡，并通过与许多衔接分子相互作用与恶性进展相关。然而，MLF1在肝内胆管癌中的表达模式和生物学作用尚不清楚。

DNA甲基化异常和microRNA失调参与了包括肝癌在内的人类肿瘤的发生。几种肿瘤抑制microRNA，如：miR-342-3p、miR-212-3p和miR-424-5p，在肝癌中显著下调，并通过调控其靶向的致癌基因的表达而发挥抗肿瘤作用。研究表明，启动子区CpG位点的高甲基化导致miR-212-3p和miR-424-5p下调，从而引起肝内胆管癌中癌基因：MUC13和COL12A1的表达上调。然而，miR-342-3p在肝癌中的下调机制尚不清楚。microRNA在肝内胆管癌发生和发展中失调的分子机制仍有待阐明。

EGFR/AKT或Wnt/β-catenin信号通路在肝内胆管癌细胞生长和转移中起关键作用。然而，在肝内胆管癌中，EGFR/AKT和Wnt/β-catenin信号通路之间是否存在相互作用尚不清楚。因此，作者开展了这项研究，探讨MLF1在肝内胆管癌中的表达情况、临床相关性、生物学功能和表观遗传调控机制。

研究路线

研究内容
1、MLF1在肝内胆管癌中高表达
作者对多个公开转录组测序数据集进行的配对或非配对样本分析均显示，MLF1在肝内胆管癌中的mRNA表达水平相对于邻近的非肿瘤肝组织显著上调，作者通过免疫印迹和RT-PCR，在10对肝内胆管癌组织标本中验证了MLF1的表达趋势。此外，与正常肝内胆管细胞系：HIBEpiC相比，MLF1在人肝内胆管癌细胞系：HuCCT1、CCLP1、HCCC9810和RBE中的表达显著上调。

免疫荧光和免疫组化结果显示，MLF1蛋白在肝内胆管癌细胞的细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达。此外，在4个独立的iCCA数据集中，MLF1与肝内胆管癌常规生物标志物：KRT19和MUC1的表达呈正相关。

2、MLF1的高表达与肝内胆管癌患者的预后不良相关
根据TNM分期或淋巴结累及对MLF1表达谱的分层分析显示，MLF1在晚期肝内胆管癌或淋巴结转移患者中表达升高。根据MLF1 mRNA水平的最佳截断值：5.517或10.04 (log2)，将来自OEP001105或TCGA队列的肝内胆管癌患者分为两组，Kaplan-Meier生存曲线显示，MLF1高表达的肝内胆管癌患者的总生存期较差。

此外，MLF1蛋白高表达的肝内胆管癌患者总生存期显著缩短，且复发风险高于MLF1低表达的患者(p=0.01)。多因素分析表明，MLF1蛋白高表达是肝内胆管癌患者总生存期差的独立风险因素。

3、MLF1在体内外诱导肝内胆管癌细胞的增殖和生长
作者在HuCCT1、CCLP1、HCCC9810或RBE细胞系中分别将MLF1表达沉默或过表达。细胞活力检测表明，MLF1的表达敲低可减弱HuCCT1、CCLP1和HCCC9810细胞的增殖，而MLF1的过表达可促进HuCCT1、CCLP1和RBE细胞的增殖。集落形成实验表明，MLF1的表达敲低通过降低集落形成能力而抑制肝内胆管癌细胞的生长，而MLF1过表达则表现出相反的效果。在皮下异种移植瘤模型中，MLF1的表达敲低显著抑制肿瘤生长和增殖，而MLF1的过表达则相反。在流体动力尾静脉注射的AKT/YAP诱导的肝内胆管癌模型中，CRISPR-cas9介导的MLF1表达敲除延迟了肝癌发生。

4、MLF1在体内外促进肝内胆管癌细胞的迁移、侵袭和转移
伤口愈合实验表明，MLF1敲低组的肝内胆管癌细胞的迁移显著降低，MLF1过表达组的肝内胆管癌细胞的迁移显著增加。transwell实验表明，MLF1敲低组的细胞迁移和侵袭数量明显减少，MLF1过表达组的细胞迁移和侵袭数量明显增加。在异种移植瘤转移模型中，MLF1过表达组的肺和肝脏表面转移的数量更高。同时，MLF1过表达组转移瘤的细胞增殖明显增加。免疫印迹显示，在HuCCT1或CCLP1细胞中，MLF1的表达敲低可增加E-cadherin的表达，同时降低其余EMT标志物的表达，而MLF1的过表达则具有相反的作用。此外，与EMT标志物：Vimentin和COL12A1一样，MLF1在多个iCCA数据集中与EMT基因集的富集评分呈显著正相关。

5、MLF1在肝内胆管癌细胞中调控EGFR/AKT和Wnt/β-catenin信号通路
考虑到MMP2和MMP9是肝癌中Wnt/β-catenin和EGFR/AKT通路的下游基因，而MLF1的缺失显著延缓了AKT/YAP诱导的肝癌发生。因此，作者假设MLF1、EGFR、AKT和β-catenin串扰的调控网络参与了肝内胆管癌的发生和发展。免疫印迹显示，MLF1表达敲低的iCCA细胞中，EGFR、AKT、p-AKT、β-catenin和p-β-catenin的表达降低；MLF1过表达的iCCA细胞中，EGFR、AKT、p-AKT、β-catenin和p-β-catenin的表达升高；而MLF1表达敲低或过表达对p-EGFR的影响较小，说明MLF1在调控EGFR/AKT和β-catenin信号通路中起关键作用。此外，与配对的非肿瘤肝组织相比，EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、β-catenin和p-β-catenin在肝内胆管癌中的蛋白表达与MLF1一样呈升高趋势。

在MLF1表达敲低的肝内胆管癌细胞中，β-catenin的核定位降低；而在MLF1过表达的肝内胆管癌细胞中，β-catenin的核定位增加。TOPFlash报告基因分析显示，MLF1表达敲低的肝内胆管癌细胞中，Wnt/β-catenin信号通路活性显著降低；MLF1过表达的肝内胆管癌细胞中，Wnt/β-catenin信号通路活性显著升高，表明MLF1调控肝内胆管癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。

6、MLF1通过激活典型Wnt信号级联而调控β-catenin信号通路
鉴于经典的Wnt/β-catenin通路是由Wnt配体或GSK3β激活的，因此，作者研究了MLF1是否影响GSK3β或Wnt3在肝内胆管癌细胞中的表达。与β-catenin的变化一样，在MLF1表达敲低的HCCC9810细胞中，Wnt3和p-GSK3β的表达减少，而在MLF1过表达的CCLP1细胞中，Wnt3和p-GSK3β的表达增加，表明MLF1对β-catenin信号通路活性的调控与Wnt3/GSK3β有关。

由于β-catenin是肝脏发育、健康和疾病中的典型Wnt信号级联的中心效应物，因此，作者进一步评估了MLF1对肝内胆管癌细胞中Wnt信号级联相关基因表达的影响。免疫印迹和RT-PCR结果显示，MLF1的过表达降低了CK1a的表达，增加了FZD1、Axin1/2和LRP6的表达；而MLF1的表达敲低则表现出相反的效果，表明MLF1通过激活肝内胆管癌细胞中典型的Wnt信号级联而调控β-catenin信号通路。

7、MLF1与肝内胆管癌细胞的凋亡逃逸相关
MLF1可减轻肺腺癌细胞的凋亡。免疫印迹显示，MLF1的表达敲低增加了肝内胆管癌细胞中凋亡蛋白：CASP3的表达，降低了抗凋亡蛋白：BCL2和BCL-XL的表达，而MLF1过表达则效果相反。此外，对异种移植瘤的TUNEL染色证实，MLF1介导了肝内胆管癌的细胞凋亡，结果显示，MLF1表达敲低组的异种移植瘤的凋亡发生率显著增加。

8、MLF1在肝内胆管癌细胞基因组的结合区
AlphaFold的结构预测表明，MLF1蛋白可以结合DNA并影响多个基因的表达，因此可能在细胞核中发挥转录因子的功能。为了研究MLF1是否在转录水平上调控EGFR和AKT的表达，作者对HuCCT1细胞进行了ChIP-seq分析。在HuCCT1细胞的基因组中确定了MLF1结合区。其中，14.17%位于启动子区域的±2 kb内。对MLF1结合位点进行Motif富集分析，确定了它们在基因组中的结合偏好。MLF1结合的DNA基序与RUNX3、TCF7、Nkx2-2等转录因子的结合基序匹配良好。此外，PI3K-AKT信号通路(EGFR/AKT信号通路)是MLF1结合区富集的关键通路之一。这些结果表明，MLF1可以调控其靶向基因的表达，并在转录水平上调控EGFR/AKT信号通路。

9、体突变基因：IDH1、FGFR2、BAP1、ARID1A、KRAS、TP53和CDKN2A对MLF1在肝内胆管癌中表达的影响
先前的组学研究已经揭示了肝内胆管癌的遗传变异谱，不同中心的肝内胆管癌患者在突变分布和突变特征上存在很大的差异。为了研究肝内胆管癌中MLF1与遗传变异之间的关系，作者首先通过IDH1、FGFR2、BAP1、ARID1A、KRAS、TP53或CDKN2A拷贝数改变对MLF1的表达进行分层。在TCGA数据集中，IDH1、FGFR2或TP53的拷贝数增加降低了MLF1的表达，而BAP1、ARID1A、KRAS或CDKN2A的拷贝数增加对肝内胆管癌中MLF1的表达没有显著影响。在OEP001105数据集中，IDH1、FGFR2、BAP1、ARID1A、KRAS、TP53或CDKN2A拷贝数的改变没有显著影响MLF1的表达。

作者进一步分析了MLF1与肝内胆管癌中单核苷酸变异的关系。在TCGA数据集中，MLF1的表达在野生型和突变型之间没有显著差异。在OEP001105数据集中，KRAS突变增加了MLF1的表达，IDH1或BAP1突变降低了MLF1的表达，FGFR2、ARID1A、TP53或CDKN2A的突变对MLF1的表达无显著影响。这些结果表明，IDH1、BAP1、KRAS、FGFR2或TP53突变对肝内胆管癌中MLF1表达的影响存在不同的地域模式。

10、MLF1在肝内胆管癌中的启动子甲基化模式
MLF1拷贝数的改变对其在肝内胆管癌中的表达无显著影响。为了进一步确定启动子低甲基化或去甲基化是否会诱导肝内胆管癌中MLF1的上调，作者通过对2组DNA甲基化数据集的重新分析，解读了MLF1启动子的甲基化模式。结果显示，相对于配对的非肿瘤肝组织样本，MLF1启动子在肝内胆管癌中并未去甲基化，这表明MLF1在肝内胆管癌中的上调与其启动子甲基化模式无关。

11、MLF1在肝内胆管癌细胞中与miR-29c-3p直接结合
TargetScanHuman数据库v7.2预测显示，3个候选microRNA：miR-29c-3p、 miR-29b-3p和miR-29a-3p可以与MLF1的 3′UTR结合。作者随后研究了miR-29家族成员在肝内胆管癌中的表达模式，发现miR-29c-3p和miR-29c-5p在肝内胆管癌中显著下调，并与MLF1的mRNA表达呈负相关，而其余的microRNAs：miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-3p、miR-29b-1-5p和miR-29b-2-5p在癌与癌旁组织中无差异。这些结果在TCGA的肝内胆管癌数据集重新分析中得到了进一步证实。此外，miR-29c-3p的过表达抑制MLF1的表达，而miR-29c-3p表达抑制具有相反的作用。然而，当miR-29a-3p和miR-29b-3p过表达后，除了CCLP1细胞，在HuCCT1和CCLP1细胞中均未观察到这种变化。

在miR-29c-3p与野生型MLF1 3′UTR共转染的HEK-293T细胞中，荧光素酶活性显著降低；在miR-29c-3p与突变型MLF1 3′UTR共转染的HEK-293T细胞中，荧光素酶活性显著升高。免疫印迹显示，在HuCCT1和CCLP1细胞中，miR-29c-3p过表达抑制了MLF1、AKT、p-AKT、β-catenin和p-β-catenin的表达；而miR-29c-3p表达抑制的作用相反。这些结果表明，miR-29c-3p可以通过靶向肝内胆管癌细胞中的MLF1，使其翻译抑制或降解，进而调控AKT和β-catenin的信号转导活性。

12、miR-29c-3p在肝内胆管癌中的治疗潜力
为了评估miR-29c-3p的治疗价值，作者用miR-29c-3p激动剂(一种改良的miR-29c-3p模拟物)处理荷瘤小鼠。在异种移植瘤模型中，与对照组相比，miR-29c-3p治疗组的肿瘤明显消退。miR-29c-3p治疗组中的MLF1表达明显低于对照组。在AKT/YAP诱导的肝内胆管癌模型中，miR-29c-3p治疗组肿瘤负荷明显降低。免疫组化染色显示，MLF1在miR-29c-3p治疗组中表达下调。

13、miR-29c-3p在肝内胆管癌中的启动子高甲基化导致其下调
研究表明，miR-212-3p和miR-424-5p在肝内胆管癌中的启动子CpG位点的高甲基化使其表达沉默。为了揭示肝内胆管癌细胞中miR-29c-3p的下调机制，作者鉴定了一个miR-29c启动子序列。转染含启动子质粒的HEK-293T细胞荧光素酶活性显著高于转染无启动子质粒的HEK-293T细胞，表明该启动子序列具有转录活性。靶向亚硫酸氢盐测序显示，miR-29c启动子的CpG位点甲基化程度在肝内胆管癌组织中明显高于配对的癌旁组织。此外，在肝内胆管癌样本中，miR-29c启动子的甲基化程度与miR-29c-3p的表达呈负相关。这些结果表明，miR-29c-3p在肝内胆管癌中启动子CpG位点的高甲基化与其下调有关。

14、DNMT1、3A和3B在肝内胆管癌细胞中的上调决定了miR-29c启动子的高甲基化
越来越多的证据表明，异常高甲基化在肝癌的发生和发展中起着至关重要的作用。然而，DNA甲基化转移酶在肝内胆管癌中的表达模式并不清楚。与TCGA和E-MTAB-6389数据集的结果一致，免疫印迹和RT-PCR显示，DNMT1、3A和3B在超过60%的肝内胆管癌样本中上调。在TCGA样本中，MiR-29c-3p和miR-29c-5p与DNMT1、3A和3B的表达呈负相关。地西他滨处理后，miR-29c在HuCCT1和CCLP1细胞中的启动子甲基化程度降低；同时，miR-29c-3p的表达显著升高。此外，作者用DNMT抑制剂：地西他滨治疗荷瘤小鼠，发现地西他滨治疗组与对照组相比，异种移植瘤负荷减轻。与对照组相比，MLF1在地西他滨组的异种移植瘤中的表达降低，而miR-29c-3p的表达升高。

研究结论

本研究表明，高甲基化介导的miR-29c-3p下调有助于肝内胆管癌中MLF1的表达上调，从而通过调控EGFR/AKT和Wnt/β-catenin信号通路导致肿瘤细胞的增殖和转移，促进肝内胆管癌的进展。miR-29c-3p模拟物或MLF1的潜在靶向抑制剂在肝内胆管癌中具有治疗潜力。

参考文献
Tang Z, Yang Y, Chen W, Liang T. Epigenetic deregulation of MLF1 drives intrahepatic cholangiocarcinoma progression through EGFR/AKT and Wnt/β-catenin signaling. Hepatol Commun. 2023 Jul 24;7(8):e0204. doi: 10.1097/HC9.0000000000000204. PMID: 37486965; PMCID: PMC10368384.