利用缺氧的signature评估胶质瘤的肿瘤免疫微环境与预后

Characterization　of Hypoxia Signature to Evaluate the Uumor Immune Microenvironment and Predict Prognosis in Glioma Groups

利用缺氧的signature评估胶质瘤的肿瘤免疫微环境与预后

胶质瘤包括低级胶质瘤（LGG）和胶质母细胞瘤（GBM），缺氧是胶质瘤恶性表型的驱动因素。从中国胶质瘤基因组图谱（CGGA，文章笔误为GGGA）中下载575例LGG和354 例GBM样本。并从TCGA下载530例LGG和167 例GBM样本的数据。文章开发了一个缺氧模型来评估胶质瘤的免疫微环境与预后之间的关联。发现高的缺氧评分与不良预后相关。基因集富集分析发现高风险人群相关的基因集富集在免疫抑制信号转导中。

材料方法

从CGGA（www.cgga.org.cn）作为训练集获得了575名LGG患者和354名GBM患者的RNA-seq和临床信息。从TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）下载了530名LGG患者和167名GBM患者作为验证集。利用CIBERSORT的LM22矩阵来评估22种免疫细胞类型的比例。使用单变量Cox回归计算与生存统计学显著的缺氧基因。使用R中的survival和Survminer软件包的Kaplan-Meier分析比较患者的OS。通过survivorROC包验证风险模型在预测患者OS方面的准确性。

结果

1. 低氧风险特征的特征可预测脑胶质瘤的预后

缺氧相关的基因集来自于MSigDB（hallmark-hypoxia），其中包含200个因低氧水平而上调的基因。使用STRING在线数据库和Cytoscape进行PPI分析（图1A）。使用CGGA训练数据集对基因进行了单因素和多因素Cox回归分析。发现20个与缺氧相关的基因与患者的OS显著相关。使用多因素Cox分析选择5个P<0.05的缺氧相关基因来构建预测模型（图1B）。风险评分公式：risk score = (0.90×VEGFA) + (0.51×HK2) + (1.18×JUN) + (1.12×LDHA) + (1.29×GAPDH)。且在CGGA（图1C）和TCGA数据集（图1D）中，均发现五个基因之间都具有显著相关性。

图1.脑胶质瘤预后相关的低氧基因特征

2. 胶质瘤组低氧风险得分的预后价值

由于缺氧通常会促进肿瘤的侵略性表型。发现CGGA和TCGA数据库中较高的风险评分样本中，五个缺氧相关基因的表达上调（图2A）。且高风险组的死亡率显著高于低风险组（图2B，C）。且在CGGA和TCGA队列中，高风险评分的患者的OS明显短于LGG低评分的患者（图2E，F）。在GBM中，高风险预测OS较差（图2G，H）。

图2.胶质瘤缺氧风险得分的预后价值

3. 缺氧基因表达与胶质瘤的临床病理特征相关。

进一步系统研究了五个缺氧基因与胶质瘤病理特征之间的关系，包括WHO等级，IDH和1p/19q共缺失状态。不同WHO等级之间基因表达水平差异（图3A，B）。通过箱式图展示也发现缺氧基因差异上调（图3C，D）。在具有野生型IDH（图3E）和野生型1p/19q共缺失（图3F）的胶质瘤中，五个基因的表达水平显著升高。

图3.低氧基因表达与神经胶质瘤的临床病理特征

4. 低氧风险signature的预后评估能力

为了评估低氧风险信号在1年、3年和5年生存率中的预测效率，绘制了CGGA数据集下的ROC曲线，表明具有较高的预测值（图4A）。且TCGA数据集进一步得到验证（图4B）。单因素分析表明，风险评分与不良OS显著相关（图4C）。多变量分析显示，高缺氧风险评分与胶质瘤患者的OS有关（图4D）。且该结论在TCGA数据集中得到验证（图4E，F）。

图4.胶质瘤缺氧风险信号的预后价值

5. GSEA识别缺氧相关的信号通路

进一步挖掘在高缺氧风险组中激活的信号通路，对高、低缺氧风险组进行GSEA分析。在高风险组中富集到刺激肿瘤增殖和抗凋亡的过程有关，例如缺氧，DNA修复等（图5A）。且在TCGA数据库中得到了进一步验证（图5B）。

图5.低和高缺氧风险人群之间的GSEA富集分析

6. 低和高缺氧风险脑胶质瘤患者之间的免疫状况

越来越多的证据表明，低氧微环境可能会抑制抗免疫效应从而促进免疫逃逸。使用CIBERSORT方法与LM22矩阵，估计低风险和高风险神经胶质瘤患者22种免疫细胞类型的免疫浸润水平（图6A）。缺氧风险高的患者中，免疫抑制细胞（例如Tregs）的比例明显较高（图6B–D），静息T细胞和NK细胞（图6E-G）也表现出差异。进行GSEA分析，发现高风险胶质瘤显著富集了免疫过程负调控（图6H）。

图6.低和高缺氧风险脑胶质瘤患者之间的免疫状况

7. 低氧风险评分高与免疫抑制微环境

癌症免疫周期基因的signature来自于（http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/index.jsp）。在高缺氧风险组中，与癌症-免疫周期的负调控有关的基因大部分上调（图7A，B）。且风险评分正相关的PD1和PD-L1在差异表达（图7C-F）。高缺氧风险组中免疫检查点基因（CTLA-4和LAG-3）表达显著高于低风险组（图7G，H）。高缺氧风险组的免疫抑制细胞因子也被上调（图7I，J）。

图7.高缺氧风险评分表明存在免疫抑制性微环境。

8. 低氧风险signature在LGG中的预后价值