溶杆菌抗生素抗性转录组文章发表微生物重量级期刊

微生物转录组研究是揭示微生物功能机制的重要手段。近日，客户开展吲哚通过激活一种新型的双功能泵逆转细菌固有抗生素抗性转录组文章成功发表在生物一区&微生物一区杂志《mBio》，影响因子6.747。

吲哚信号传导是许多研究小组研究的重要的细菌通讯手段。以前的研究集中在吲哚影响细菌抗生素耐受性。然而，与吲哚诱导的抗生素抗性的研究相比，吲哚降低抗生素抗性的机制在很大程度上是未知的。本研究首次报道了信号分子吲哚通过调控细菌内向转运泵来逆转细菌固有抗生素耐药性。

研究选取Lysobacter enzymogenes YC36作为模型系统，构建基因缺失的载体的菌株突变体，检测抗生素抗性和机制。质粒pHmgA-P用于基因互补测定。

转录组测序：L. enzymogenes YC36含有和不含吲哚（吲哚浓度0.5mM）。

L. enzymogenes YC36能够在有或没有抗生素处理的情况下正常伸长和增殖。当向培养物中加入抗生素和吲哚时，细胞停止生长或死于细胞裂解（下图A和B）。对于阴性对照表明，单独的吲哚不会对细胞生长产生任何不利影响，证实吲哚和抗生素的组合是导致观察到的细胞死亡的原因（下图C）。

转录分析表明，吲哚处理后257个基因上调，111个基因下调。上调节基因包括编码四环素抗性阻遏蛋白的tetR和编码HTH型转录调节因子LuxR。此外，已经注释为与维生素B12的合成和转运相关的10个基因簇被吲哚显着上调。编码ATP结合蛋白的btuD基因的表达上调10倍，并且btuD侧翼的基因类似地上调至不同程度（下图D和E）。该10个基因簇对于溶杆菌属中的所有物种是共同的（下图F）。

图1

（A）吲哚降低了Lysobacter spp的卡那霉素和氨苄青霉素抗生素抗性。将吲哚与固体40％浓度的TSB培养基混合。吲哚的最终浓度为0.5mM。（B）动态成像实验评估不同处理下的L. momogenes YC36生长。氨苄青霉素和卡那霉素的浓度分别为100μg/ ml和50μg/ ml。（C）在0.5mM吲哚（右）或不存在吲哚（左）的情况下培养24小时后的Lysobacter生长检测。（D）显示维生素B12基因簇的相对转录水平的热图。热图下方的比例表示相对表达水平的倍数变化。（E）L. enzymogenes YC36中维生素B12基因的相对表达水平的实时PCR测定。在培养开始时将吲哚（0.5mM）加入到40％浓度的TSB培养基中。（F）Lysobacter spp.的维生素B12基因聚类分析。

构建ΔbtuD突变体，ELISA和HPLC测定维生素B12含量。发现0.5mM吲哚显着提高了维生素B12的吸收效率，ΔbtuD具有较弱的维生素B12吸收效率，但在btuD互补ΔbtuD后btuD菌株中恢复了维生素B12摄取的效率，这表明维生素B12的摄取与ButD相关。Kana-CFDA-SE的动态成像显示抗生素在吲哚处理的细胞中积累，但抗生素进入ΔbtuD突变细胞被抑制，这证实BtuD负责细胞摄取抗生素（下图）。

图2 btuD的双重功能分析

（A）野生型（WT）和btuD缺失突变体和btuD互补菌株的维生素B12含量。（B）WT和btuD突变体在不同维生素B12条件下（存在或不存在0.5mM吲哚）的生长速度。在培养开始时将吲哚和维生素B 12加入培养基中。（C和D）WT和btuD突变体在50μg/ ml卡那霉素（存在或不存在0.5mM吲哚）下的存活状态。（E和F）WT和ΔbtuD在不同培养条件下运输卡那霉素的荧光成像分析。

那么问题来了，IRAR是否只是Lysobacter spp.的特殊现象呢？作者随后研究了不同细菌物种吲哚的IRAR作用。

外源性吲哚能够使抗生素进入南极假单胞菌细胞并有效积累（下图A）。

嗜麦芽寡养单胞菌对多种抗生素的抗性使得临床治疗特别困难，IRAR极大地改善了抗生素对嗜麦芽窄食单胞菌的治疗效果（下图B）。

吲哚还显着提高了农业中常见致病菌Ganthomonas cucurbitae对传统抗生素的敏感性（下图B）。

对于IRAR菌株，谷氨酸（E）而不是Q位于Q环区域周围（下图C）。

推测IRAR物种Q环的这一新特征改变了BtuD和BtuC相互作用的方式。

研究还发现，IRAR现象敏感地依赖于细菌种群密度，即Lysobacter spp的内在抗生素抗性当细胞密度足够高时恢复。当OD600为0.7时，培养的细胞完全不受影响（下图）。Lysobacter菌株都含有由LeDSF诱导的特殊群体感应系统，LeDSF是一种可扩散的信号因子样分子（下图D）。LeDSF生物合成基因簇包含rpfC, rpfG, rpfF和rpfB。Δrpf突变体中完全丧失恢复的抗生素抗性（下图E），补充的LeDSF在抗生素处理下完全恢复了ΔrpfF细胞的生长。ΔrpfG和ΔrpfB突变体显示出与野生型菌株相似的生长，这表明rpfG和rpfB的功能可以被基因组中的同源物替代。

图4 在IRAR过程中涉及LeDSF诱导的群体依赖性行为。

（A）固定相中的IRAR效应（高细胞密度，OD为1.0）。（B）在不同条件下生长和分裂高密度细胞（OD为1.0）。（C）在不同时间点（OD分别为0, 0.4和0.7）向培养基中加入外源0.5mM吲哚以检测IRAR效应。（D）LeDSF生物合成基因簇的组成。（E）在高密度野生型菌株和LeDSF相关的ΔrpfC和ΔrpfF突变体中的IRAR过程检测。（F）在有或没有外源5M LeDSF的抗生素处理下ΔrpfF和ΔrpfC突变体的生长曲线。培养开始时添加LeDSF。（G）具有0.5mM吲哚处理的野生型和ΔrpfC突变菌株中btuD的相对表达水平。（H）Lysobacter中IRAR的示意图。

【参考文献】

Indole Reverses Intrinsic Antibiotic Resistance by Activating a Novel Dual-Function Importer. mBio, 2019.