Microbiome：扩增子检测环境样本单细胞真核生物和寄生虫的新方法

人类历史上，几次严重疾病是由蚊媒或水和食物污染传播的真核寄生虫引起。这些病原体仅为真核单细胞和寄生虫很小比例，环境中有很多未知的生物很微小但对健康有普遍的影响。目前，人们对细菌甚至真菌有很好的分子生物学分析工具，但对大多细单细胞真核和寄生虫认识很少，检测这些物种通常靠显微镜，无法区分相关物种，分子水平仅能检测特异病原菌。

本研究提出一种16S测序类似的高通量测序方法，可以检测大范围的单细胞真核生物和寄生虫，包括所有人类寄生虫的物种分类群。

主要结果

研究设计了13对引物扩增人类寄生虫（下表）：顶复亚门Apicomplexa, 变形虫Amoeba, 酵母菌属Blastocystis,双滴虫Diplomonadida, 动体目Kinetoplastida,副基体门Parabasalia, 线虫Nematoda, 扁形动物Platyhelminthes和微孢子Microsporidia。引物需满足以下要求：①需要扩增目标群体中全部物种，只有很少的非特异扩增；②需要鉴定的物种序列有足够的可区分遗传信息；③扩增产物应该足够短，可被Illumina测序。

表1 展示了每对引物扩增长度，以及电子评估扩增范围、信息含量和特异性。电子模拟可扩增的物种(NCBI中公开的物种)数量，DNA序列匹配为单独的属或种比例，属于目标类群的比例。最后两栏为引物序列。

本文从复杂生物（人类粪便，CO₂诱捕的诱捕器）和环境样品（河水，土壤）中提取DNA。采用13对引物进行扩增和测序后（下图），从这些样品的单细胞真核生物或蠕虫中获得了11个的DNA序列（下表2）。在83个水对照中（即没有模板），只有6个与单细胞真核生物或蠕虫物种匹配的reads超过10个，平均reads为87个，而实际样品中每个寄生虫的平均reads为1258个。

模式图 展示扩增、添加标签(barcoding)、混样和测序的流程。

每类样本和每类引物，可扩增多达5个物种匹配DNA序列，与NCBI鉴定比例较一致。当一种DNA序列与多个属匹配相等时，结果被标明。

从孟加拉国约300个人类粪便样品中提取的DNA中，变形虫引物产生了三个不同的DNA序列。一个序列与Entamoeba hartmanni（哈氏肠球菌）相似，而另一个与人类肠道的两个共生体即Entamoeba dispar相似。扩增出的第三个序列与Endolimax nana最相似，但是只有87%的相似性，见下图A重建扩增序列与NCBI中序列的进化树，并且可能起源于尚未在该基因座进行测序的相关变形虫（可能是Iodamoeba物种）。

水和土壤样品中，从许多单细胞真核生物（e.g. Lecythium hyalinum,Rhynchomonas sp., Bodo saltans）和蠕虫（e.g. Cura sp.,Prismatolaimus sp.）中扩增到了DNA序列。在水体样本中确定了与动物肠道中常见的生物（e.g. Enteromonas hominis）最相似的序列，以及双翅目（Diplomonadida）中的许多未表征物种，包括自由生活和寄生的生物（下图B），说明此方法可用于监测水质或安全。最后，从所有用CO₂诱捕的诱捕器中提取的DNA中扩增到了大量昆虫已知寄生虫（e.g. Crithidia sp., Mermithidae sp.）以及吸血昆虫传播的鸟类寄生虫DNA序列。

A.邻接树展示注释的变形虫序列(黑方块)和人类粪便中扩增的序列(绿钻)；B.邻接树展示注释的双滴虫序列(黑方块)、粪便扩增的序列(绿钻或圆)，和三个波托马可河样本中扩增序列(棕色菱形)。

总结

参考文献