利用WGCNA分析NK/T细胞淋巴瘤的致癌网络和Hub基因

Oncogenic Network and Hub Genes for Natural Killer/T-Cell Lymphoma Utilizing WGCNA利用WGCNA分析NK/T细胞淋巴瘤的致癌网络和Hub基因4.137

Front Oncol . 2020 Mar 5;10:223. doi: 10.3389/fonc.2020.00223. eCollection 2020.

Abstract

Natural killer (NK)/T-cell lymphoma (NKTCL) is a subtype of non-Hodgkin lymphoma with aggressive progression and poor prognosis. The molecular mechanisms of NKTCL have not been well-studied. Herein, we revealed the lymphoma-associated dysregulated genes and signaling pathways or biological processes in NKTCL. We characterized that the extracellular matrix (ECM) receptor interaction pathway and T-cell receptor signaling pathway were the main dysregulated pathways in NKTCL by Gene Ontology (GO) analysis and pathway enrichment analysis. By using weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), the gene co-expression network of NKTCL (SRP049695) was constructed, and hub genes (LMO3, GRB14) were identified. In addition, another Gene Expression Omnibus (GEO) dataset (GSE69406) was used to validate these hub genes. Furthermore, these hub genes were identified and validated by survival analysis (GSE90597). These results provided novel insights into the pathogenesis of NKTCL. Of particular interest, LMO3 and GRB14 might be potential oncoproteins and biomarkers for the diagnosis and treatment of NKTCL.

Keywords: GRB14; LMO3; co-expression network; natural killer/T-cell lymphoma (NKTCL); weight gene co-expression network analysis (WGCNA).

NK/T细胞淋巴瘤（NKTCL）是起源于NK/T细胞的淋巴系统恶性肿瘤，属于非霍奇金淋巴瘤的一种亚型，鼻腔是最常见的原发部位，具有侵袭性且预后较差。这篇文章主要是用SRA的数据（SRP049695）对NKTCL的基本分子特征进行了研究。文章关键结果是用WGCNA结合两套GEO数据验证得到了两个hub基因（LMO3和GRB14），可能是诊断和治疗NKTCL的潜在癌基因和生物标志物。
SRA原始数据处理流程
SRA数据（SRP049695）是包括3个正常NK细胞样本和15个NKTCL样本的RNA-Seq原始数据。文章中用TrimGalore过滤低质量的原始读数：（1）去除引物；（2）去除末端低质量的序列；（3）去除<35bp的序列。用HISAT2组装（hg19）。用Cufflinks计算mRNA和lncRNA的FPKM。
结果
1.差异表达基因的GO功能和KEGG通路的富集分析
文章使用Cuffdiff筛选正常NK细胞和NKTCL样本之间的差异表达基因（DEG）（阈值：p <0.05；log 2FC> 1或log 2FC < -1；q <0.05）。总共6680个mRNA在NKTCL中显示出差异表达，包括5664个上调的和1016个下调的。

通过R包Cluster Profiler对DEG进行了GO（BP）和KEGG的富集分析。GO的结果显示上调的DEGs显著富集在胞外结构组织，循环系统过程，血液循环，细胞外基质（ECM）组织等功能（图1B），而下调的DEGs则显著富集在T细胞活化，淋巴细胞分化，造血调节，细胞粘附，髓样细胞分化等功能（图1C）。 KEGG结果显示，上调的DEGs富集在核糖体，ECM-受体相互作用和细胞粘附分子（CAMs）等通路（图1D），而下调的DEGs富集到T细胞受体信号，趋化因子信号，和FoxO信号等通路（图1E）。

图1.转录组概况和差异基因功能

2.NK/T细胞淋巴瘤的GSEA分析
文章还将SRP049695的所有表达数据集进行了基因集富集分析（GSEA），肿瘤样本在补体系统，ECM受体相互作用和局灶性黏附通路中富集（图2A）。对照样本在T细胞受体，NK细胞介导的细胞毒性和脂肪细胞因子信号通路中丰富（图2B）。

图2.GSEA结果

3.PPI网

文章用STRING得到了DEGs的相互作用蛋白和基因并构建了PPI网络（图3A）。用MCODE计算基因的k-core和挖掘核心模块。发现40个最高的k-core基因组成两个重要的网络，一个是G蛋白偶联受体信号通路，另一个是ECM受体信号通路（图3B），这可能暗示了NKTCL发病的潜在机制。

图3.DEGs 的PPI网络
4.WGCNA
为了阐明NKTCL中的关键模块和基因，文章用R包WGCNA分析了NKTCL的高度相关的基因和共表达网络。首先排除了低质量的两个样本（图4A），β的幂自动设置为14以确保无标度网络（图4B）。另外模块基因的最小数量设置为30，层次聚类树状图用不同的颜色概括了基因模块，通过聚类树状图鉴定出18个基因模块。最后分析了基因模块之间的相互作用，并使用相应的分层聚类树状图和模块生成基因网络的TOM图展示（图4D）。

图4.WGCNA结果
5.识别NK/T细胞淋巴瘤的Hub基因
为了从WGCNA生成的巨大的基因网络中找到hub 基因，文章设置边的权重> 0.6来缩小网络，结果得到了包括325个节点和6,900个边的网络，其中图5A显示了两个关键的子网。通过分析基因节点的度和k-core发现一些可能是构成网络核心的mRNA和LncRNA，例如LMO3，PEG3，GRB14，ASB9和lnc-FRG2-13，lnc-F11-2，lnc-GALNT9-4，LINC01206。以k-core>60为阈值得到了57个核心基因并在火山图中标注了前10个（图5B），另外作者还绘制了最大的FC值和最显著的P值的两个基因LMO3和PEG3的共表达基因网络。

图5.识别Hub基因
6.Hub基因的验证
为了验证从WGCNA筛选出的可能的hub基因，文章用GSE69406数据验证上文的k-core前10的基因（小编：前文中的10个hub包含一个LncRNA，这里验证的是9个mRNA），即LMO3，PEG3，ASB9，GRB14，REEP1，SLC30A3，LY6K，TMEM59L和LDHAL6B。发现在NKTCL中LMO3，PEG3，GRB14和LDHAL6B被显著上调，而ASB9等基因在NKTCL与对照组之间则没有显著变化（图6A）。另外为了揭示这些基因的表达与预后之间的关系，文章用GSE90597数据集绘制了Kaplan–Meier生存曲线。发现，LMO3（p = 0.044）和GRB14（p = 0.027）的过表达与较短的OS显著相关。

图6.GEO数据验证

总之，文章用了一套SRA数据分析了NKTCL的差异基因及其功能，并利用互作网络分析得到了一些核心基因，为NKTCL诊断和治疗提供了潜在的生物标志物。

转自生信人

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