客户文章解读（Plant Cell）

引言：碱基的切除修复对动植物活性DNA的去甲基化及DNA损伤修复至关重要。北京大学与清华大学的联合团队针对模式植物拟南芥，利用转基因技术和多种实验方法对基因组的稳定性及表观修饰变化进行了研究，验证了两种酶类在维持表观及基因组稳定性过程中发挥的作用。文章近期发表在《Plant Cell》（IF=8.228）上，云生物的技术团队有幸参与其中，为此研究提供了分析支持。

研究重点关注的是两类酶：嘌呤/嘧啶核酸内切酶2（APE2）及锌指DNA 3’-磷酸酯酶。在模式植物拟南芥中，利用两种酶的基因位点敲除个体，研究这两种酶类在活性DNA去甲基化及DNA损伤修复过程中的作用。通过全基因组甲基化等研究手段，验证了APE2及ZDP在维持表观及基因组稳定性中发挥重叠作用。

材料方法：

1.模式植物拟南芥

• Col-0野生型

• zdp突变型

• ros突变型

2.转基因植物

• Col-0野生型引入APE等位基因ape2-2,ape2-3

• zdp突变型引入APE等位基因突变获得双突变株zdp ape2-2和zdp ape2-3

3.Chop-pcr

4.基因特异性亚硫酸氢盐测序

5.全基因组甲基化测序

6.RT-PCR等实验手段

主要结果：

1. ape2及zdp ape2突变对DNA甲基化基因座的特异性影响：利用Chop-PCR验证了四种突变体在特定去甲基化位点（DT）的甲基化水平，发现DT-75,DT-76位点上ape2-2,ape2-3单突变株发现高水平甲基化，但在DT-77,DT-78位点在单、双突变株中甲基化水平发生差异（Fig.1A）。这一点通过甲基化测序得到验证（Fig.1B）。表明APE2对活性DNA去甲基化是必须的，且APE2和ZDP在一些基因位置上有功能重叠。

2. ape2及zdp ape2突变在全基因范围内对DNA甲基化的影响：为研究突变造成的全局影响，研究中对ape2-2,zdp-1,zdp-1 ape2-2及ros1-4突变体开展了全基因组甲基化WGBS测序。在双突变体中，甲基化水平变化位点数较单突变体大幅度升高，且全部Chop-pcr标记位点在WGBS中均得到验证

研究中发现，APE2缺失会影响基因区的DNA去甲基化，而在双突变体中，DNA的甲基化维持作用增强。

3. APE2及ZDP在活性DNA去甲基化中起重叠作用：基于依赖APE2或ZDP实现DNA去甲基化过程，可以将双突变体中的高甲基化水平位点分为四类(Fig.2A)：第一类是受ZDP和APE2双重影响的位点；第二类是在单突变体中发生甲基化水平升高，在双突变体中作用加强的位点，提示二者的作用可以叠加；第三，四类是只在单突变体中出现高甲基化水平的位点（Fig.2B&2C）。

4. APE2和ZDP作用于ROS1下游：通过比较ape2单突变体，zdp-1ape2-2双突变体与ros1-4突变个体中高水平DMRs，来确定APE2在ROS-1介导的活性DNA去甲基化中的作用。研究发现了大量的与ros1-4中一致的高水平DMRs，这些DMRs在全部突变体中甲基化水平都有升高（Fig.3A&3B）。在ape2-2和zdp-1ape2-2的高DMRs中，所有突变体中CG甲基化水平明显升高，CHG和CHH甲基化水平未见明显改变（Fig.3A&3B）。研究进一步检查了在zdp-1 ape2-2中发现高甲基化区域中不同突变体的甲基化水平（Fig.3C）。

5. zdp ape2双突变体显示多效发育缺陷：尽管DNA甲基化发生了改变，但是几个单突变体在正常生长条件下没有表现出明显的发育表型差异。然而在双突变体中显示多效表型，包括纸条和根部生长的延迟，以及成体阶段叶型的变化（Fig.4）在转基因表达ZDP和APE2的双突变体中，多效表型效应减弱（Fig.4）。这表明，ZDP和APE2的功能障碍是造成这种多效发育缺陷的原因。

6. DNA损伤在zdp ape2双突变体中积累：双突变体中的发育缺陷提示有DNA损伤修复的过程受损。因此，检验了单，双突变体对MMS的敏感性发现zdp-1突变体在MMS处理后存活率有下降（Fig.5A & 5B），而双突变体的敏感性更高。对植物鲜重的研究也发现此现象（Fig.5B）。

为检测双突变体中的DNA链断裂，研究利用彗星实验检测DNA SSB及DSB（Fig.5C&5D)，结果提示DNA损伤在双突变体中有积累。

7. 双突变体中DNA损伤应答（DDR）被激活：ADP-ribosyl是一种重要的翻译后修饰，参与碱基切除修复，SSB修复和DSB修复的早期反应，研究中用抗PAR抗体检测不同突变类型中DDR活化过程（Fig.6A），结果表明，一些DDR在双突变体中被组成型激活（FiG.6B），并且还验证了在双突变体中DDR会引发细胞周期停滞（Fig.6C&6D）。

8. 双突变体中组成型DNA损伤部分是DNA去甲基化缺陷的结果：ROS1在没有下游酶的情况下可以切除5mC,当保持未加工和未修复时，可能成为DNA损伤的重要来源。研究发现ROS1功能障碍一定程度上缓解了双突变体的发育缺陷和MMS敏感性（Fig.7A-D）。此外，RT-PCR结果显示，BRCA1和RAD51以及CYCB1；1的活化因ros1-4的突变引入而显著受损（Fig.7E）。双突变体中的DNA损伤部分来自ROS1产物的缺陷加工，ROS1在双突变体的DNA损伤中起主导作用。

9. APE2具有3’-磷酸酶活性和强烈的3‘-5’核酸外切酶活性：研究还探讨了APE2是否和ZDP一样具有3‘-磷酸酶活性问题。对DNA底物（Fig.8A），具有3’-OH末端的DNA底物进行APE2作用（Fig.8B），分析结果倾向于认为APE2将3‘-P转化为3’-OH，再展现外切酶活性，但无法直接降解3‘-P底物（Fig.8C）。此外，证实APE2除3‘-5’核酸外切酶活性外还具有3’-磷酸酶活性（Fig.8D），这种酶活性状态与EEP结构域及Zf-GRF结构域密切相关（Fig.8E&8F）。