转录组测序RNA-seq,无疑是研究时空异质性的基因表达的利器。用了那么多年的RNA-seq,你的转录组结果真的精准吗?
来瞅瞅你做过(或者没做过,正准备搞起)的转录组测序流程:
真实比例为1:3:4的三个片段,在经历了建库过程中的PCR和测序之后,由于PCR偏好性等的影响,定量比例异变为了4:6:9 —— 通过转录组测序获得的信息虽在一定程度上能够反映出表达量的高低,但由于误差引入,定量结果与真实值之间的偏差甚至错误还是存在的。
给你的RNA一个UMI,转录组定量更精准!
来看看UMI到底是何方神圣,又是如何实现了我们最最关注的“精准”二字?!
UMI-Unique Molecular Identifier,即单分子标签。顾名思义,给每个单分子带上一个特有的标签,之后无论是PCR还是测序文库构建上机,这些标签都会跟核酸片段的单分子一起被复制。测序数据中,可以通过UMI实现真正的序列多拷贝和假性(PCR偏好或其他因素造成)多拷贝的区分。通过UMI进行定量统计,结果自然更精准!
图中的圆形彩色小球代表的就是我们表现出色的UMI-adaptors了。从上图不难看出,既往基于序列数进行定量,在采用了UMI标记之后,根据UMI的种类定量,可以精确的区分扩增造成的多拷贝和真实的自然多拷贝。1:3:4的最终定量结果与真实值保持一致。
除了定量,UMI标签还能帮助我们实现“超强纠错”功能——给每个RNA片段配备一个与众不同的UMI的标签,通过扩增产生的多个拷贝在测序数据水平进行比对,可以检测出扩增和测序过程引入的错误: