STTT IF=81.2 | PBA 单囊泡技术首次绘制 CLAD 移植物外泌体的单囊泡异质性图谱

文章信息

题目｜An integrated multiomic single-vesicle atlas delineates graft exosome heterogeneity in chronic lung allograft dysfunction

期刊｜Signal Transduction and Targeted Therapy

影响因子｜81.2

发表时间｜2026年9月

通讯作者｜刘伦旭、田东

DOI｜10.1038/s41392-026-02927-7

研究设计

样本

  • 动物样本：雄性 Lewis 与 Brown Norway（BN）大鼠，SPF 级，体重 250–300 g，10–12 周龄。Syn 组（同基因，BN→BN）N = 6；CR 组（MHC 不匹配，BN→Lewis）N = 9。

  • PBA 单囊泡测序样本：为减少批次效应，Syn 组随机取 3 只、CR 组取全部 9 只，共 12 个移植物样本。

  • 临床样本：2025 年 12 月至 2026 年 2 月于无锡人民医院采集血浆，共 10 例（RAS 限制性移植物综合征 5 例 + 稳定（STA）受者 5 例），均签署知情同意。

方法

  • 病理学评估：HE、Masson 三色（MT）、天狼星红染色；按 ISHLT 标准与 Martinu 等法对 A/B 级、血管内皮炎、血管纤维化、P-AF、O-AF、OB%、上皮增生/扁平、实质纤维化（PF%）、胸膜厚度进行半定量（双盲，ImageJ 定量）。

  • 外泌体提取与纯化：组织解离→差速离心（300×g、2000×g、10000×g）→0.22 μm 过滤→150000×g 120 min 超速离心沉淀→尺寸排阻柱纯化→100-kDa 超滤浓缩。

  • 外泌体鉴定：NanoFCM 测粒径/浓度；TEM 观察杯状形态；Western blot 检测阳性标志 TSG101/Alix/HSP70 与阴性标志 Calnexin。

  • PBA 单囊泡膜蛋白质组学：ExoSeek panel260（深圳 Secretech），260 种寡核苷酸标记抗体同时检测 260 个膜蛋白。

  • Bulk 蛋白质组学：4D-DIA。

  • 非靶向代谢组学：LC-MS。

  • 细胞溯源：基于 CellMarker 与 Protein Atlas 数据库，按 top1 膜蛋白判定来源。

  • 多组学整合：WGCNA（蛋白 power=4、最小模块 30；代谢 power=7、最小模块 30）、多组学相关分析、KEGG/iPath 富集、PPI 网络。

核心发现与技术亮点

1. 建立 CR 大鼠模型及移植物来源外泌体的定量与鉴定

图1｜(a) CR 组（BN→Lewis）与 Syn 组（BN→BN）实验流程示意图及各组左肺典型组织学（HE、MT 染色，10×）；(b) 各组 CLAD 病理分级半定量（A 级、血管内皮炎、血管纤维化、B 级、P-AF、OB%、O-AF、上皮增生、上皮扁平、实质纤维化%、胸膜厚度 μm）；(c) NanoFCM 两组的囊泡粒径分布（纵轴外泌体浓度/mL，横轴粒径 nm）；(d) 电镜观察外泌体形态（标尺 0.5 μm 与 200 nm）；(e) 外泌体 TSG101、Alix、HSP70、Calnexin 的 Western blot（对照裂解液 CL 为 lane 1，Syn/CR 为 lane 2）。

2. CR 移植物中 14 个外泌体膜蛋白亚群

图2｜(a) Syn 与 CR 组外泌体异质性的 t-SNE 图；(b) 14 个亚群在两组中的丰度箱线图；(c) 按不同细胞来源的 8 个亚群丰度小提琴图；(d) 各亚群丰度与 CR 组病理分级的相关热图；(e) 不同细胞来源亚群与 CLAD 病理分级的相关热图（上三角 r 值、下三角 P 值）。

3. 14 个外泌体亚群对 CLAD 发展的分子贡献

图3｜(a) 样本蛋白表达 PCA 图；(b) Syn/CR 组间差异蛋白火山图；(c) 外泌体亚群丰度与蛋白表达的相关热图（左全部样本、右仅 CR 样本）；(d) 上调/下调蛋白 KEGG 富集棒棒糖图（色深为 −log10 P，气泡大小为富集蛋白数）；(e) 14 个亚群相关蛋白数及主要 KEGG 富集环形条形图（中心连线为共同细胞来源）。

4. 14 个外泌体亚群对 CLAD 发展的代谢贡献

图4｜(a) 代谢物表达 PCA；(b) 差异代谢物火山图；(c) 差异代谢物 VIP 评分点图与丰度热图；(d) 差异代谢物 KEGG 富集棒棒糖图（横轴 DA 评分）；(e) 全部/仅 CR 样本亚群丰度与代谢物表达的相关热图；(f) 14 个亚群相关代谢物数量条形图及 top 富集 KEGG 通路，周围为不同细胞来源外泌体的 top5 富集通路。

5. 影响 CLAD 的两组功能相反外泌体的多组学机制

图5｜(a) cluster 1/2/4/9 与 5/12/13 丰度相关热图；(b) 各亚群 PBA 表达模式相关热图；(c)(d) cluster 1/2/4 组与 5/12/13 组差异蛋白/差异代谢物的韦恩图；(e) 两组交集蛋白与代谢物共同富集 KEGG 条形图（粉=代谢物富因子、蓝=蛋白富因子）；(f)(g) 交集蛋白韦恩图与富集 KEGG（含 PROMEblue/PROturquoise 模块）；(h)(i) 交集代谢物韦恩图与富集 KEGG。

6. RAS 中 Ilkhigh 外泌体的验证与多组学机制

图6｜(a)(b) RAS 与稳定（STA）受者外泌体 NanoFCM 分析（左粒径分布、右浓度散点）；(c) 两组外泌体浓度条形图；(d)(e)(f) 每囊泡 Ilk、Mrc1、Nt5e 表达箱线图；(g) 由 cluster 12 与胸膜增厚核心相关蛋白构建的 PPI 枢纽网络（节点中心色=CR 组上/下调，边框色=与 cluster 12 丰度正/负相关）及能量代谢 iPath 图。

总结

本文是首篇系统描绘 CLAD 移植物外泌体单囊泡异质性的多组学研究，建立了 14 簇外泌体图谱并归并为两大功能模块，鉴定出 cluster 12（Ilkhigh）作为与 RAS 胸膜增厚强相关、在患者血浆中可检测的保护性外泌体亚群，为 CLAD 的机制解析、分型、无创诊断与靶向治疗提供了新资源与新思路。


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