2024年4月11日，深圳市第二人民医院（深圳大学第一附属医院）|深圳市转化医学研究院汤弋哲研究员团队在国际权威专业期刊Journal of Extracellular Vesicles杂志（五年平均IF:20.6）上在线发表了题为“Surface protein profiling and subtyping of extracellular vesicles in body fluids reveals non-CSF biomarkers of Alzheimer’s disease”的研究论文。他们利用瑞典乌普萨拉大学吴迪、蔡延玲博士等于2019年开发的邻近编码技术（PBA）结合单细胞外囊泡（EV）分析和机器学习方法，获得了存在于尿液和口腔灌洗液等无创体液中、有潜力能准确诊断AD的EV膜蛋白生物标志物。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD ）是导致全球残疾和死亡的主要原因之一，目前影响着全球 5000 多万人，中国约有病患 1000万人，而发病率还在不断上升。以伦卡奈单抗为代表的最新 AD 药物在展现出对早期患者良好治疗效果的同时，也进一步凸显了早期发现和诊断 AD 的重要性。目前最有潜力的 AD候选早期生物标志物仍依赖于复杂的脑成像或脑脊液检查，不仅成本高昂，操作繁琐，而且有创并存在健康损伤风险（脑脊液提取），导致很大一部分AD患者，包括暂时无症状或轻微症状者，未被及时发现和诊断。因此，如何在尽量减少对患者的操作和创伤的前提下挖掘能准确诊断AD的生物标志物是领域的一个重要发展方向。

细胞外囊泡（EV）几乎存在于身体的所有体液中，具有稳定的磷脂双分子层膜结构，并携带蛋白、核酸等含有丰富生物信息的大分子、可反映其来源细胞的生理和病理状态，是一类理想的候选生物标志物。但是，常规的检测方法（如质谱和RNA测序）需要较高纯度和较大数量的EV才能对其中的蛋白或RNA进行准确的定性或定量，使其很难用于大部分人体体液EV的检测。此外，EV具有高度异质性，从整体水平进行检测很可能忽视其中最具有疾病提示作用、来源于病变组织细胞的EV亚群及其携带的特异大分子。

在该研究工作中，研究人员首先在AD小鼠模型（APP/PS1转基因）中验证了采用PBA技术可以在多种未经提纯和浓缩的无创体液和血液中检测到足够多的EV以及EV表面蛋白（每份样本中数千到数十万个EV不等），以及这些EV蛋白在疾病和对照组中有着足够的差异性用以寻找标志物。研究发现，在整体水平上呈现差异的EV表面蛋白可以很好的用来区分疾病和对照小鼠样本，依其构建的诊断模型也可以在疾病表型尚不明显的早期阶段判断样本的类别，并且诊断准确率随着小鼠的AD样病理进展而提升。

小鼠尿液EV差异表达蛋白随月龄变化；尿液EV模型对AD模型小鼠的盲诊断效果

随后课题组与医院神经内科合作纳入了近20对性别、年龄匹配的AD患者和认知功能正常的志愿者作为研究对象，收集了口腔和眼球灌洗液、尿液以及血液样本，并用PBA对体液中EV进行了检测。但是与小鼠结果不同，利用AD患者中差异EV蛋白构建的诊断模型仅能勉强判断AD或对照样本类型，这可能与人类样本存在较大的个体间差异有关，而能准确反映AD状态的EV可能仅占其全体的很小一部分。

为了找到能指示AD的EV亚群，课题组首先对不同体液中的EV总群进行了亚群分析。结果显示EV总群可以完全分成20-25个亚群，每个亚群存在1-3个特征蛋白进行鉴别和区分。随后对每个EV亚群中与AD相关的差异表达蛋白进行机器学习建模和诊断准确度分析，发现尿液和口腔灌洗液中EV亚群及其差异蛋白构建的诊断模型对盲样本的诊断准确率优于其他无创体液和血液EV，其中一个尿液EV亚群和一个口腔灌洗液EV亚群的准确率（AUC）分别达到88%和81%。进一步分析准确率最高的尿液EV亚群发现，这个亚群在AD患者中高表达PLAU/ANXA1/ITGAX三种EV膜蛋白，并且其中两种蛋白阳性的EV数量在AD患者尿液中也分别显著增加。PLAU是一种尿激酶类型的纤维蛋白溶酶原激活体，在先前的研究中已被发现与晚发型AD存在遗传相关性。ANXA1和ITGAX已知与AD关联的小胶质细胞（DAM）关联，在小胶质细胞介导的神经炎症、Aβ的清除、血脑屏障完整性等生理和病理功能上起到重要作用。这些结果提示一些体液EV亚群不仅是优秀的AD诊断生物标志物，还能反映AD的重要病理进程。

人类尿液、口腔灌洗液和血浆EV的亚群结构

总之，该研究运用新诞生的PBA技术平台探索了多种无创体液EV作为AD诊断标志物的可行性和有效性，极大的扩展了疾病体外分子诊断标志物的选择范围。研究意外发现，无论是在AD小鼠模型还是在人类AD患者当中，尿液EV相比于其他检测的体液EV是更好的诊断标志物，其中一PLAU/ANXA1/ITGAX高表达的AD相关亚群接近实现高准确率的诊断。该研究朝着简单、高效、低成本的AD无创体液诊断迈出了重要的一步。