文献分享｜分离技术和冻融对血浆细胞外囊泡异质性和亚群分析的影响的系统评估

该研究系统比较了三种血浆细胞外囊泡（EVs）分离策略——非对称流场分离（AF4）、尺寸排阻色谱（SEC）与 结合功能化膜的自动化离心微流体盘系统（Exo-CMDS），以比较它们在新鲜冷冻血浆和单次冻融血浆样本中分离EVs的效率。研究综合应用邻近编码技术（PBA)进行单个EV表面蛋白分析，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行整体蛋白质组学解析，结合透射电子显微镜（TEM）评估形态、纳米粒子跟踪分析（NTA）测定粒径和浓度，从多个层面，为血浆EVs分离方法的选择和标准化提供了系统性评价。



文章信息


  • 题目｜Systematic Evaluation of Isolation Techniques and Freeze-Thaw Effects on Plasma Extracellular Vesicle Heterogeneity and Subpopulation Profiling

  • 期刊｜Journal of Extracellular Biology（国际细胞外囊泡学会 ISEV 官方期刊之一）

  • 发表时间｜2025年6月

  • 通讯作者｜徐涛院士 钟雯研究员

  • DOI｜10.1002/jex2.70058

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背景简介


细胞外囊泡（EVs）是携带 DNA、RNA、蛋白质和脂质等生物分子的膜性囊泡，参与细胞间通讯，并在免疫应答、组织修复及疾病进展中发挥重要作用。血浆 EVs 易于获取，可反映多组织信息，具有早期诊断和疗效评估潜力，但其高度异质性及缺乏标准化分离方法限制了研究与应用。

传统方法（超速离心、密度梯度和SEC）在纯度、效率和亚群覆盖上存在差异，而新兴技术如AF4和Exo-CMDS可实现高效、可重复的分离。本研究比较了三种血浆 EVs 分离方法（AF4、SEC、Exo-CMDS），揭示了各技术的优势与局限，并评估冻融处理对EVs的影响，为 EVs 研究的标准化操作和临床应用提供参考。



研究设计概览


样本：血浆，来自健康志愿者（25岁男性），多种EVs纯化方法的起始体积均为500 μL；另设未冻融与单次冻融组两组。

三类分离策略：

  • AF4：按颗粒大小分层的流场分离方法。

  • SEC：通过多孔柱按大小分离颗粒的方法。

  • Exo-CMDS：离心驱动的微流控膜捕获分离系统。

检测手段：

  • TEM/NTA → 比较形态和粒径

  • PBA → 单个EV层面检测262种表面蛋白

  • LC-MS/MS → 全面蛋白质组

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主要发现①：EVs 形态学与粒径/产率（TEM+NTA）


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EVs 形态学与粒径/产率：

  • 形态：三种方法均见典型EV形态（TEM）；

  • 产率：SEC最高、Exo-CMDS次之、AF4最低（NTA，FDR<0.05）；

  • 粒径分布：AF4最窄 ~50–130 nm；SEC ~50–160 nm；Exo-CMDS最宽 ~50–190 nm。

冻融影响：单次冻融操作对EVs浓度与粒径分布均无显著影响。



主要发现②：EVs 亚群差异（PBA）


识别出15个EVs亚群，不同方法各具偏好：

  • AF4 → 富集经典跨膜蛋白亚群（CD151、CD81、CD9等）；

  • Exo-CMDS → 富集免疫相关蛋白亚群（如CD5、NT5E、TNFRSF9、ITGB2）；

  • SEC → 富集SEC偏好的EVs亚群（代表性标志物：THBD、SELL、CDH12 等）。

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主要发现③：血浆直接检测 vs SEC 分离（PBA）


研究特别比较了原始血浆（plasma control）与SEC分离后的EVs在PBA分析中的结果。

  • UMAP分布图显示，两者高度重叠，说明SEC分离组与直接血浆的 EVs表面蛋白亚群构成几乎一致。

  • 这意味着：在PBA检测场景下，直接血浆即可获得与SEC分离相当的结果，而不必额外增加 SEC 步骤。

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主要发现④：蛋白质组学（LC-MS/MS）


蛋白覆盖：

  • 共定量1588个蛋白；AF4 1514 > Exo-CMDS 583 > SEC 500；共同蛋白370。

特异性蛋白及亚群：

  • AF4：富集核源性组分、细胞‑基质连接蛋白及蛋白酶体相关蛋白，捕获更多 exomere/supermere（极小外泌体/超级外泌体颗粒）；

  • Exo‑CMDS：富集内质网、高尔基体及细胞外基质相关蛋白，同时富含血小板颗粒标记蛋白的EVs；

  • SEC：富集蛋白‑脂质复合物和免疫球蛋白复合物。

冻融效应：单次冷冻‑解冻对EVs蛋白谱和亚群分布均无显著影响（PBA与LC-MS/MS两层面一致）。

组织来源：Exo‑CMDS和SEC高表达蛋白，以及共同蛋白簇主要来源于肝脏。

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综合结论


  • AF4：纯度高，粒径分布较均一，蛋白覆盖度最广，但操作相对复杂、耗时较长；

  • SEC：产率最高，但伴随脂蛋白等非囊泡成分共分离，适合对大规模样本进行初筛或探索性研究；

  • Exo-CMDS：产率中等，特异性富集免疫相关亚群，样本间一致性最佳，显示出在大规模样本分析和临床研究中应用的潜力；

  • 冻融效应：单次冻融对 EVs 的形态、表面蛋白组学及整体蛋白质组特征无显著影响，为样本库和临床样本保存提供了方法学依据。



结语


本研究通过多角度、多层次的比较，深入探讨了不同EVs分离方法的优缺点，并评估了单次冻融处理对EVs稳定性的影响，这为EVs研究的标准化操作、临床样本储存策略及功能性亚群识别提供了方法学依据，有助于推动EVs在疾病诊断和治疗中的应用。


  • 转自泌码生物

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