PBA单外泌体蛋白检测 | Nature Communciations| 发现脓毒血症相关的外泌体并溯源

研究背景

  1. 脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）死亡率高，且目前缺乏能够早期识别、判断严重程度和预后的无创生物标志物。
  2. 尿源性细胞外泌体（uEV）携带肾脏细胞类型特异的膜蛋白，理论上可反映实时肾损伤状态。
  3. 既往EV研究多采用“批量”蛋白质组，掩盖了EV亚群异质性；单外泌体水平的研究尚未在AKI领域开展。

    研究目的

    用单外泌体蛋白质组学技术（Proximity Barcode Assay, PBA）解析uEV亚群，寻找可在独立队列中验证的、能预测SA-AKI的无创标志物。


    设计与方法

  1. 发现阶段
    • 收集ICU脓毒症患者24 h尿液（n = 20 AKI vs 20 非AKI）。
    • PBA技术：对每个uEV表面标记>50种蛋白，通过DNA条形码+NGS定量，实现“单外泌体蛋白组”。
    • t-SNE降维将32个亚群可视化，比较AKI/非AKI亚群比例差异。

  2. 验证阶段
    • 多中心前瞻性队列：70 SA-AKI，44 非AKI脓毒症，20 健康对照。
    • 用ELISA和纳米流式分别定量CD35阳性uEV，并以外泌体标准化。
    • 评估诊断效能（ROC）、与KDIGO分期、持续AKI、恢复时间及炎症指标的相关性。

  3. 功能/溯源实验
    • 单分子荧光共定位：CD35/CD63/CD81共染，确认定位。
    • Western blot、免疫电镜：验证CD35在AKI中下调。
    • 生物信息学：KEGG、NMF聚类、机器学习模型（5种算法）筛选最优标志物。


主要结果

  1. uEV亚群图谱
    • 32个亚群中，CMR-EV（CD21+/CD35+）在AKI组显著减少。
    • 其他差异亚群：EC-EV（内皮来源）、TEC-EV（肾小管上皮）、IMR-EV（免疫调节）、LYS-EV（溶酶体相关）。

  2. 单外泌体差异蛋白
    • 44个外泌体表面蛋白差异表达；CD35下调最显著；CD21变化不显著。
    • PCA、共识聚类、NMF均显示CD35可区分AKI/非AKI。

  3. 独立验证队列
    • CD35-uEV在SA-AKI组较非AKI组下降约6倍，健康对照与非AKI无差异。
    • ROC：区分SA-AKI vs 非AKI脓毒症 AUC 0.89。
    • 与病情严重程度：
    – KDIGO 1/2/3期呈阶梯式下降。
    – 持续AKI vs 暂时AKI：AUC 0.77；低CD35-uEV患者恢复时间更长。
    • 多因素校正后，CD35-uEV仍是eGFR下降及峰值Scr的独立预测因子。

  4. 溯源与机制线索
    • 单分子共定位显示CD35-uEV主要来自足细胞（与nephrin共定位）；既往文献亦报道足细胞可脱落CR1/CD35。
    • 下调的蛋白富集于补体/凝血通路；上调蛋白富集炎症-粘附通路，提示补体调节失衡参与SA-AKI。

    原文链接：

    Single urinary extracellular vesicle proteomics identifies complement receptor CD35 as a biomarker for sepsis-associated acute kidney injury

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