RNA水平下苔藓-真菌共生态研究

微生物组的研究，着实火爆了这些年的科研圈儿，不知道有没有“研友”留意到微生物组存在的一个特点——它有点像RNA的研究，在不同的时间和空间，微生物群落的存在状态也是有差异的。这一点，在人体的研究中已经得到大量的验证：

在植物体中，是不是也存在这样的特点呢？ 植物相关微生物的存在状态和植物的“精气神”又有什么样的相关性呢？又如何实现对真菌活性的研究呢？

今天，就来跟大家分享一篇关于植物和微生物研究的经典文献，看看植物共生微生物群落有什么样的特点？

《RNA-based analyses reveal fungal communities structured by a senescence gradient in the moss Dicranum scoparium and the presence of putative multi-trophic fungi》

这篇经典研究文献今年2月发表在著名植物学杂志《New Phytologist》（IF=7.433）上，首先来看看这篇文章的关注点：

由于可以从活体或已经死亡的植物中分离出来，很多的植物共生真菌被认为具有共生和腐食性特征。但很少有研究关注到植物共生真菌的“时空分布特点”，比如在植物体衰老的不同阶段共生真菌群落，以及真菌活性的问题。

由于同时考虑到菌群“活性”的探查，这篇研究中采用了基于RNA的测序研究手段——包括cDNA扩增子测序及宏转录组测序，对自然衰老梯度Dicranum scoparium (苔藓植物)的配子体上分布的真菌群落进行检测,探明了分布在活体，衰老及死亡组织上的具有活性的真菌群落结构。此外，研究中还采用了实验室培养及田间采集样本比较等在内的多种方法进行了验证。

群落结构研究发现：子囊菌（Ascomycota）在所有衰老梯度的组织中都是活跃的，与之相反，担子菌（Basidiomycota）在衰老及死亡组织中活跃并普遍存在。有一些真菌在活的及死亡的组织中都存在并具有活性，提示这类真菌多元的营养方式。

方法学结果比对：文中反复提及到cDNA的扩增子测序的方法，一方面，这种基于RNA的研究手段可以实现菌群活性的检测，另一方面，相比于大数据通量高成本的宏转录组研究，无疑实现了微生物组研究的高性价比要求。从本文的研究结果看，cDNA扩增子测序可以鉴定出更多的OTU，与宏转录组结合的方法可用于研究含有复杂微生物多样性的共生系统，可以同时检测其存在及活性。

从全文看，研究不仅关注了植物共生真菌群体在时间和空间分布上的延续性，还关注了真菌活性状态，此外，多种技术手段的比较也是文章的一大亮点。接下来，我们就来看看这篇研究的细节是如何安排的——

实验设计：

杜克森林样地取样，划分三个样方（b图）作为生物学重复进行取样，苔藓位置上取样划分不同层次取生物学重复（a图）：

样本分不同衰老梯度抽提RNA，开展宏转录组测序、cDNA扩增子测序、表面消毒培养及ITS测序及真菌子实体收集ITS测序等，进行不同衰老组织共生真菌群落结构的研究（c图）：

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取样策略包含了植物的不同衰老阶段，基于Bray-curtis对宏转录组研究数据开展分析，可见在不同衰老阶段活性真菌的群落分布都是有显著差异性的（a/b/d/e图），在cDNA扩增子测序中（c/f图），也得到了同样的模式结论。

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宏转录组研究发现植株底部有17个OTUs相较于顶部丰度更高活性更强，反之在顶部也有4个OTUs相较于底部风度更高活性更强（Fig.a-d）

还有一些OTUs贯穿植物体全部位置，并没有观察到分布差异性存在（Fig.e-h）

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从900个配子体中分离出398个真菌，基于95%的序列相似性，这些真菌属于61个OTU。通过分层比对分析，发现真菌菌丝在植株的光合组织中含量丰富。从大田收集的配子体中分离或实验室培育的子实体鉴定发现，大部分真菌为担子菌(Basidiomycota)。此外还发现未经鉴定分类的子囊菌（Apothecia）直接在配子体上生长或孵育。

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基于扩增子测序及宏转录组研究结果，发现子囊菌（Apothecia）在苔藓植物顶部绿色活性的组织中丰度较高，而担子菌（Basidiomycota）则在底部衰老褐色组织中丰度较高（下图）在纯培养的样本中也发现了这样的趋势（g图）。

伞菌、散囊菌纲等物种含量也较丰富（h-m图），但分布趋势略有差异。自然条件及培养条件下，附生真菌群落也有一些变化。

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尽管数据集之间存在一定的差异性，但代表Chaetothyrials和Helotiales的OTU无论在宏转录组还是扩增子研究中都在丰度排名前5的行列。表面消毒样本中分离培养的OTU中Sordariomycetes的丰度排名在前三。这些都是与D.scoparium共生的优势真菌OTU（下图列举了D.scoparium共生的前30个丰度优势真菌）

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研究还比较了不同方法检测到了真菌群落差异性，发现不同的方法中都存在一些其他方法检测不到的OTU。而扩增子测序的方法检测到的OTU最多（下图）。