临床NGS数据中的病原微生物检测

• 可以获得临床样品中所有物种的DNA序列

  
  

• 对于低丰度物种的检出率高

  
  

• 相对于传统的PCR检测方法，检测谱广，可以鉴定到未知的疑似病原菌

• 病原菌的丰度可能非常低，宿主的污染非常严重，临床样品来源纷杂，干扰的物种信息也非常复杂

• 暂时没有公认的阈值系统，即统计学显著的检测指标

  
  

• 时效性相对于PCR，还有明显的劣势

一、质控

1. 常规的质控QC与Trim获得CleanData

2. 屏蔽含有重复区域的Reads，该步骤比较特殊，建议进行

原因（a）该类型序列常属于物种的重复序列，丰度异常

（b）物种间存在相同的重复序列，不去除会导致错误的Reads比对结果

二、数据库准备

1. 前景数据库（Forground DB）

疑似病原菌的所有物种基因组序列

2. 背景数据库（Background DB）

NT数据库中，去除前景数据库物种的其他物种序列

三、比对

使用bowtie2在严格敏感度模式下进行序列比对，NGS领域免费的软件特别多，很多科研工作者偏爱使用默认参数。

然而，在临床数据分析中，很少使用默认参数，一般都采取严格的参数标准，这点需要注意。

1. 首先比对Background DB，删去比对上的Reads

2. 其次比对Forground DB，获得比对上的Reads

3. 将2步获得的Reads重新使用BLASTN方法比对NT数据库，查找每个Reads对应的所有物种信息

四、物种鉴定（LCA方法）

该步骤非常重要！

生物科学家的误区：Reads比对到一个物种A基因组，那么这条Reads就来源于物种A

原因在于：使用一种比对软件进行序列比较，第一个比对结果未必是准确无误的，可能第二个、第三个等比对指标与第一个几乎完全相同

此时如果后续的结果与第一个来源于同一个物种没问题，但是如果与第一个物种不同，那么该结果如何处理？

为了解决以上问题，分析时常常采用 LCA（最近公共祖先）算法，具体如下图——

解释1：

假设Reads1 BLASTN NT数据库后，存在8个比对结果，这些结果分别来源于进化树Tree中的不同物种，那么 4 和 8 的所有祖先中，相同的且深度最大的为 2，那么4和8 的LCA为2；同理，Reads1的比对结果真正的物种为1。

解释2：

假设Reads1 BLASTN NT数据库后，存在3个比对结果符合比对cutoff，即5,7和8

那么Reads1的比对结果对应的真正物种为5。

以上的举例非常简单，结合目前NCBI Taxonomy Treee的复杂度，需要借助软件进行Reads来源的确定。

PAIPline流程中默认使用LCA方法进行物种注释。

五、统计量构造

大家都知道：目前NGS在临床使用最成熟的技术就是无创产检（NIPT），关键在于通过统计分析（Z score）可以非常有效检出三体胎儿，同时显著降低假阴性的数据量。

因此构造一个类似的统计量对于一种技术的广泛应用非常关键。

PAIPline流程构建自己的F score，对结果进行统计测验。

具体如下——

P=TP/(TP+FP)

R=TP/(TP+FN)

F score=2/(1/R+1/P)

TP：真阳性数量；FP：假阳性数量；FN：假阴性数量

很明显：F越大，可靠性越高

作者将PAIPline与已知的物种鉴定软件进行了比较，发现其经过严格的过滤与分析，比现有的Meta-物种鉴定软件表现显著提升。