组织芯片使用指南

组织芯片使用指南

一、产品规格：

产品规格

基片类型

备注

组织芯片正式片

Thermo 4951P玻片

标配1张

组织芯片预实验片

世泰防脱玻片

可选（生存期芯片标配1张）

二、使用前准备：使用前将组织芯片放于玻片架上，如下图所示：标签栏朝上与水平成一倾斜角度，60℃左右烘烤2~3小时将表面封蜡融掉。（可根据实际情况延长融蜡时间）。

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组织芯片使用——免疫组化试验操作步骤

一、仪器设备

1.   18cm不锈钢高压锅和电炉

2.   医用微波炉

3.   水浴箱

4.   冰箱-18℃-4℃

5.   湿盒

6.   耐高温塑料切片架

7.   可调微量移液器

8.   定时器

9.   pH计

二、试剂

1.   PBS（磷酸盐缓冲液pH7.2~7.4）NaCl 137mmol/LKCl 2.7mmol/LNa2HPO4 4.3mmol/LKH2PO4 1.4mmol/L

2.   柠檬酸盐缓冲液CBpH6.00.01mol/L1000ml配制柠檬酸三钠 3g柠

檬酸 0.4g   

3.   酶消化液 a0.1%胰蛋白酶液用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制 b0.4%胃蛋白酶液用0.1N的HCl配制   


三、操作流程

1 脱蜡和水化   脱蜡前将组织芯片放在60恒温箱中烘烤30分钟   

1)    置于二甲苯I中浸泡10分钟，在二甲苯II中浸泡10分钟，在二甲苯III中浸泡10分钟，在二甲苯Ⅳ中浸泡10分钟；   

2)    无水乙醇I中浸泡5分钟在无水乙醇II中再浸泡5分钟；

3)    95%乙醇中浸泡5分钟；

4)    85%乙醇中浸泡5分钟；   

5)    70%乙醇中浸泡5分钟；

6)    蒸馏水中浸泡5分钟；

2 抗原修复　用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片

1）    抗原热修复

       a) 高温高压热修复

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气，从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后，用PBS洗5分钟。

b)　微波热修复    

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中中，高档继续处理10-15分钟，取出微波盒冷却至室温，取出玻片先用蒸馏水洗两次，后用PBS洗5分钟。


2）   酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶，使用前酶预热至37°，切片也预热至37°，消化时间为10-30分钟。

3免疫组织化学染色

       SP法

1)   脱蜡水化；

2)   蒸馏水中5分钟；

3)   用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次；

4)   抗原修复；

5)   PBS洗5分钟；

6)   滴加正常山羊血清封闭液,室温10分钟；

7)   甩去多余液体滴加一抗37℃1小时或者4℃过夜，4℃过夜后在37℃复温45分钟；

8)   PBS洗2次各5分钟；

9)   滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒；

10) PBS洗2次各5分钟；

11) 滴加HRP标记的链球菌亲和素孵育条件参见所用试剂盒；

12) PBS洗2次各5分钟；

13) DAB显色5-10分钟在显微镜下掌握染色程度；

14) 蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；

15) 脱水透明封片镜检；

       SABC法

1) 脱蜡水化；

2) 蒸馏水中5分钟；

3) 用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭510分钟蒸馏水洗1次；

4) 抗原修复；

5) PBS洗5分钟；

6) 滴加正常山羊血清封闭液室温10-20分钟甩去多余液体；

7) 滴加抗,37℃1小时或者4℃过夜，4℃过夜后在37℃复温30分钟；

8) PBS洗2次每次5分钟；

9) 滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒；

10) PBS洗2次每次5分钟；

11) 滴加试剂SABC孵育条件参见所用试剂盒；

12) PBS洗2次每次5分钟；

13) DAB显色DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色镜下掌握显色程度；

14) 蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；   

15) 脱水透明封片；

    二步法（Envison法）

1)   脱蜡水化；

2)   PBS洗3次，各6分钟；

3)   抗原修复；

4)   用蒸馏水配置新鲜的3%H2O2-甲醇室温封闭10分钟；   

5)   PBS洗3次，各6分钟；

6)   滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟；

7)   甩去多余液体滴加一抗4℃过夜；

8)   37℃复温45分钟；

9)   PBS洗3次，各8分钟；

10) 滴加二抗，室温30分钟；

11) PBS洗3次，各8分钟；

12) DAB显色10分钟在显微镜下掌握染色程度；

13) 蒸馏水洗终止染色；

14) 苏木素复染，盐酸酒精分化；

15) 脱水透明封片镜检；

注：上述冲洗步骤切勿直接对着组织冲洗，冲洗时力度要适中，以免组织芯片掉片。

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