2020年最应该看的一篇NB单细胞测序文献


前言

单细胞测序技术已经成为科研人员强有力的研究工具。目前能够进行单细胞测序分析的实验方法类型众多。有基于液滴分离的方法，有基于流式细胞术分选的方法。这些方法的数据质量如何，它们各自有什么优缺点，本文进行了系统性的比较。


基本信息

文章题目：Systematic comparative analysis of single cell RNA-sequencing methods

期刊：Nature Biotechnology


研究背景

单细胞测序技术目前处于快速发展当中，各种新技术、新方法不断被开发出来用于解决特定的生物学问题。这些方法基于不同的原理和方案，产生的结果不尽相同，对它们进行全面的相互对比，并在此基础上确定单细胞测序技术的相关质量标准，以便帮助科研工作者选择适合自己实验的技术方法，这种系统性的比较工作是目前的当务之急。过去的一些比较工作主要的缺陷在于不系统和不全，例如许多工作仅仅比较特定细胞系，而忽视了组织样本。


研究内容

作者选择了7种单细胞测序技术，对三种不同类型的样本进行了系统性的比较。7个平台中包括2种低通量技术（图1）：Smart-seq2以及CEL-Seq2；另外还有5种高通量技术，分别是：10x Chromium, Drop-seq, Seq-Well, inDrops及sci-RNA-seq。三种类型的样本分别是（图2）：人类细胞系HEK293及小鼠细胞系NIH3T3等比例混合样品；冷冻保存的人类外周血单核细胞（PBMCs: peripheral blood mononuclear cells）；以及小鼠脑部皮质组织细胞核。



图1 | 本文的单细胞测序技术平台囊括了2种低通量技术和5种高通量技术。


图2 | 采用三种类型的样本进行分析。

作者通过对六种主要指标进行了系统性的分析和比较，包括灵敏度（sensitivity）、重复性（reproducibility）、精密度（technical precision）、鉴定到的细胞类型（capturing biological information about cell types）、操作时间及成本。


研究结果

1. 相对于高通量方法，Smart-seq2以及CEL-seq2拥有更高的灵敏度（图3-5）。其余几种高通量方法的灵敏度没有明显差别。



图3 | 混合细胞系中，各种方法灵敏度比较。



图4 | PBMC样品中，各种方法灵敏度比较。

图5 | 小鼠脑皮质组织细胞核样品中，各种方法灵敏度比较。

2. 在检测的7种方法中，10x Chromium的表现最为稳定（strongest consistent performance），显示出极高的重复性（图6）。

图6 | 人类细胞系样品中，各种方法重现性比较。

3. 除Smart-seq2之外，其余6种方法的精密度均表现良好，其CV值均在0.5%以内（图7）。


图7 | 人类细胞系样品中，各种方法精密度比较。

4. sci-RNA-seq在检测中不能总是鉴定到全部的细胞类型，显示出该方法仍然需要进行改进。其余技术鉴定到的细胞类型结果较为一致（图8）。


图8 | 小鼠脑皮质组织细胞核样品中，各种方法鉴定到的细胞类型的比较。

5. Drop-seq, inDrops及Seq-Well三种技术成本最低，Smart-seq2成本最高，其余方法成本相当。但是考虑到单个细胞的成本，则是sci-RNA-seq成本最低，因为它可以实现百万级别的细胞通量。


6. 操作时间上，10x Chromium得到数据所需的时间较少，而Smart-seq2, CEL-Seq2及inDrops则耗费较长，其余方法花费的时间相当。


7. Smart-seq2尽管成本较高、通量较低同时较为费时，但是它在检测结构变异以及RNA剪切变异中具有较大优势，因为它能够测序得到基因全长，而不仅是3’端序列。


8. 相比使用单个完整细胞，使用细胞核进行单细胞测序具有几点优势：1）能够应用于冷冻保存的样品；2）能够应用于难以进行解离获得单细胞悬液的组织；3）避免解离过程对细胞转录谱的人为影响，造成结果偏差。


写在最后

细胞是生命活动的基本功能单位。生命系统的本质是不同类型细胞之间的相互作用网络。单细胞测序技术是对这一网络进行解析的最强有力的手段。目前单细胞测序技术仍然处于不断更新与开发之中，选择哪一种方法作为研究技术，是关系到实验成败的关键因素。本文为我们的选择提供了详实的数据，帮助我们根据自己的研究对象做出正确的选择。同时，文章中的数据与验证思路也是我们今后进行方法开发和升级的重要基础和起点，具有极大的参考价值和意义。

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