Science | SLAM-seq分析BRD4-MYC这一通路中二者分别直接调控的基因及功能

Matthias Muhar, et al. SLAM-seq defines direct gene-regulatory functions of the BRD4-MYC axis41.037

Science . 2018 May 18;360(6390):800-805. doi: 10.1126/science.aao2793. Epub 2018 Apr 5.

Abstract

Defining direct targets of transcription factors and regulatory pathways is key to understanding their roles in physiology and disease. We combined SLAM-seq [thiol(SH)-linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA], a method for direct quantification of newly synthesized messenger RNAs (mRNAs), with pharmacological and chemical-genetic perturbation in order to define regulatory functions of two transcriptional hubs in cancer, BRD4 and MYC, and to interrogate direct responses to BET bromodomain inhibitors (BETis). We found that BRD4 acts as general coactivator of RNA polymerase II-dependent transcription, which is broadly repressed upon high-dose BETi treatment. At doses triggering selective effects in leukemia, BETis deregulate a small set of hypersensitive targets including MYC. In contrast to BRD4, MYC primarily acts as a selective transcriptional activator controlling metabolic processes such as ribosome biogenesis and de novo purine synthesis. Our study establishes a simple and scalable strategy to identify direct transcriptional targets of any gene or pathway.


肿瘤中的转录因子和表观遗传调控的作用早已被大众所知，特别是BET家族的BRD4蛋白，能够识别组蛋白乙酰化，启动一系列基因表达，其中就包括了关键性的原癌基因，MYC转录因子（1）。基于此，BET抑制剂（BETi）也是研究和临床实验中著名的小分子，通过抑制BET蛋白的活性抑制MYC为代表的一系列关键下游基因表达，从而达到抑制肿瘤的作用。而MYC转录因子本身就是最重要的原癌基因之一，已经有许多报道能够直接调节细胞基本代谢，影响细胞生存（2）。


然而无论是BRD4、还是MYC等肿瘤关键基因，由于功能水平上相互需要、相互影响，以及研究手段无法区分等，导致了之前的研究中对于每个关键性肿瘤相关基因直接的调控下游及其功能并不清晰。本研究利用新的手段SLAM-seq，分别分析了BRD4和MYC这两个蛋白调控的下游基因及其机理，指出BRD4作为组蛋白乙酰化reader通过调节Pol2磷酸化影响几乎所有基因的转录；而MYC作为转录因子只能特异性的结合和调节自身下游基因，这一调控的Axis的两个关键蛋白在不同层面上发挥各自的作用。


SLAM-seq，即Thiol(SH)–linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA，通过向合成中的mRNA链中掺入4-thiouridine (4sU)，使得原本的碱基T被4sU修饰，从而在反转录中被错认为C，导致原本应该为碱基A的位置错配成为G。然后测序过程中通过分析这些错配的G，就可以得到新合成mRNA的信息。


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1：SLAM-seq分析BRD4功能

首先研究者构建了诱导型降解细胞：植物生长激素诱导启动（AID）表达的BRD4蛋白（Fig.1A-B），加入水稻来源的F-box蛋白Tir1，能够降解AID后面的蛋白即BRD4（Fig.1A-B）。如Figure 1A，首先利用植物生长激素IAA处理降解蛋白后，加入4sU，再收集细胞mRNA进行处理和SLAM-seq，分析结果发现：

1）BRD4降解后转录事件下降（Fig.1C）

2）不影响转录起始相关TBP1和MED1水平，不影响延伸相关的CDK9, CYCLIN T1, SPT5的水平；转录起始相关的Pol2-S5P水平稳定（Fig.1D）

3）转录延伸相关的修饰Pol2-S2P下降（Fig.1D）

4）Pol2、Pol2-S2P和Pol2-S5P的结合都有所下降（Fig.1E-F）

这些结果证明BRD4对于转录的调控并不依赖于CDK9，主要通过控制Pol2磷酸化实现。


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Figure 1

2：BET蛋白直接调控转录，不依赖于染色质结构和重塑过程

由于高浓度的JQ1（BETi）能够整体降低所有mRNA的转录水平（Fig.2A）、导致敏感细胞系的死亡，因此研究者采用低浓度JQ1，使得转录下降有了选择性（Fig.2B）。其中发现一系列对BETi处理非常敏感、且抑制在AML中非常重要的基因变化显著，包括MYC等（Fig.2C）。而CDK9抑制剂NVP-2能够抑制转录的基因，则与JQ1完全不同（Fig.2D-E）。更有趣的是，同时用JQ1和低浓度NVP-2处理细胞，表达谱又同高浓度NVP-2处理比较类似（Fig.2D-E）。

关于BET蛋白的作用，有部分理论认为是与superenhancer结构相关。因此研究者分析了BETi下游基因与包含有SE能够受到superenhancer调控的基因之间的关系，却发现两者并不重合，甚至于JQ1下调的基因中仅有1/3上面含有SE结构；甚至绝大多数包含SE结构的基因并不能被JQ1影响表达(Fig.2F-G)。例如：JQ1下调基因MYB并不含有SE；而BRD2含有SE却不能被JQ1抑制（Fig.2G）。

接下来研究者进一步分析BETi处理与DNA甲基化的关系。分析BETi敏感和不敏感基因TSS附近的ChIP和DNA甲基化测序结果进行聚类和比较分析，发现GLM类相关度好（Fig.2H-J）。GLM这其中包括了相关性正相关的转录因子、修饰，例如REST和H3K27ac（Fig.2I），也包括负相关的因子例如转录延伸相关的SUPT5H等(Fig.2I)。这些因子分别处于不同的功能分类中，提示了BETi对于转录的抑制是通过位点特异进行，而不是通过同一个或者几个染色质结构相关因子（Fig.2J）。

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Figure 2

3：MYC能够特异性调控生命活动关键基因

转录因子MYC是BETi作为抗肿瘤药物最关键的靶点之一。而且MYC本身就是最具盛名的原癌基因之一，在白血病中MYC功能至关重要，有报道称MYC可以起到广泛的的转录促进功能[3-4]。为了分析MYC直接控制转录的基因，研究者同样构建了一个MYC蛋白诱导降解的系统（Fig.3A-B），并且SLAM-seq检测了60min内由MYC诱导转录的新的mRNA，发现受影响的mRNA非常特异而不是如BRD4能够影响general transcription，并且基本都是被下调（Fig.3C）。这说明MYC在此的作用并非广泛的转录促进和转录抑制，而是特异性的转录激活。MYC能够影响许多维持细胞生存必须的通路，包括核糖体形成和功能、AMP代谢、嘌呤合成等(Fig.3C-D)，因此MYC的降解会严重影响蛋白合成过程、AMP/GMP合成受损以及伴随着的细胞增殖停滞（Fig.3E-F）。以上结果在其他细胞系中也得到相应验证（Fig.G-H）。并且寻找出的MYC下游基因与MYC的表达水平也存在很高的相关性（Fig.I-J）。

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Figure 3

讨论

在生物学和基础医学研究领域，技术革新总能够带来新的研究思路，产生有趣且高效的进展。多年前的ChIP-seq，ATAC-seq等等，都是当前表观遗传学和转录研究中必备手段。本研究中， SLAM-seq作为一种较新的测序方式，被用来分析肿瘤细胞中BRD4、MYC对转录活动的调节，分析特异性的下游基因。未来可以想见，SLAM-seq这一强大手段能够继续用于单一基因下游基因和功能分析，解析例如肿瘤相关关键基因的真正功能。


文章来源

  1. Matthias Muhar, et al. SLAM-seq defines direct gene-regulatory functions of the BRD4-MYC axis. Science 360, 800–805 (2018)

  2. Arianna Sabò and Bruno Amati. BRD4 and MYC—clarifying regulatory specificity. Science 360, (2018)

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