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TOROGreen® qPCR Mix Screening Kit

【产品货号】 QST-103

【包装规格】 3种各1管

【产品描述】

TOROGreen® qPCR Mix Screening Kit 是一种染料法2×qPCR 预混液筛选试剂盒，可快速筛选适合您实验用途的染料法qPCR预混液。本试剂盒包含QST-100、QET-100及QST-200三种染料法qPCR预混液，具高特异、高GC、高灵敏及高稳定扩增等特征，可应用于基因表达分析、熔解曲线分析、SNP基因分型等用途。本试剂均基于MIQE及ISO20395开发设计，其高特异性及高扩增效率可大大降低对引物设计的要

求，降低时间成本及金钱成本。另外试剂室温稳定，可完全室温配制，大大简化了人员操作要求。

【产品特征】

-特异性筛选：可对所有引物对进行NTC实验，筛选出最高特异性的2×qPCR 预混液。

-性能筛选：可对满足特异性的预混液，快速筛选符合实验性能要求的2×qPCR 预混液。

-室温稳定：在储存和运输过程中，性能不容易随温度变化而降低；完全室温配制体系。

【产品组成】

本筛选试剂包括如下组分：

以上三款qPCR预混液特征如下：

【引物和模板】

1. 引物设计：长度: 18~30bp ；GC含量: 40~80% ；扩增子长度: ≤ 200 bp

2. 模板类型：使用基因组DNA或cDNA模板进行梯度稀释制作标准曲线计算PCR效率及R2。

【NTC实验】

根据MIQE要求，染料法qPCR的NTC实验中必须无引物二聚体扩增，而引物二聚体的产生决定于引

物序列和qPCR试剂特异性。故对所有引物进行NTC实验是验证qPCR体系好坏的第一步，也判断染料法

qPCR试剂特异性的首要指标。

1. NTC体系配制

-使用前2×qPCR预混液必须在室温避光下完全融化，且涡旋混匀后离心后使用。

注: 由于添加了大量稳定剂，预混液中可能有结晶沉淀产生，完全融化后可以正常使用。

-按下表配制NTC反应体系：

- 移液器抽吸混合充分后瞬时离心。

- 分装20μL到qPCR管或板中，设置3个重复。

- 瞬时离心后直接上机。

备注：为了最大降低NTC扩增出现的风险，以上体系可室温放置1-2h后再进行PCR扩增。

2. 反应条件设置

3. 结果分析

- 分析所有NTC出现扩增的熔解曲线和扩增曲线。

- 统计2×qPCR预混液对所有引物的NTC扩增占比。

- 选择NTC扩增占比最小的2×qPCR预混液。

- 重新设计引物，用选定的2×qPCR预混液重复NTC实验。

- 直到所有NTC均无扩增，2×qPCR预混液和引物筛选成功。

【PCR扩增效率测试】

ΔΔCq法进行基因表达分析的必要条件是：内参及目的基因PCR效率必须一致或接近且尽可能接近

100%。同时，需在Cq值15-35范围内PCR扩增效率为90%-110%之间且R2≧0.99，方可满足MIQE基本要

求。这取决于引物序列及qPCR预混液性能，故基于“真Cq”的PCR效率是qPCR预混液的试金石。

1. 模板稀释：

- 取8个盛有90μL无酶PCR水的1.5 mL无酶离心管，在第一个管中加入10μL原始模板充分混匀。

- 取第一管内模板稀释液10μL加入第二个管内，按此方法依次梯度稀释，形成模板梯度稀释液。

2. 体系配制：

-使用前2×qPCR预混液必须在室温避光下完全融化，且涡旋混匀后离心后使用。

注: 由于添加了大量稳定剂，预混液中可能有结晶沉淀产生，完全融化后可以正常使用。

-按下表配制NTC反应体系：

- 移液器抽吸混合充分后瞬时离心。

- 按模板浓度从低到高分装20μL到qPCR管或板中，设置3个重复。

- 瞬时离心后直接上机。

3. 反应条件设置

4. 结果分析

- 分析所有PCR扩增的熔解曲线和扩增曲线，确保无引物二聚体且扩增正常。

- 统计Cq值，选取Cq值15-35之间至少5个模板稀释梯度的制作标准曲线。

- 计算PCR扩增效率及R2，在R2≧0.99时，PCR扩增效率越接近100%，qPCR预混液越好。

- 若PCR扩增效率或内参基因及目的基因扩增效率不一致时，请调整引物浓度或重新设计。

【应用案例】

1. QST-103 与V品牌NTC实验对比

图中绿色表示NTC无假扩增的占比，红色表示NTC有引物二聚体扩增的占比。随机从Nature

Communications期刊中抽取两篇论文，共涉及67引物。论文中所使用V品牌的qPCR预混液，发现67个NTC

实验中仅21个无引物二聚体扩增。体系合格率仅31.3%，论文中qPCR数据不可信。而使用QST-103的三款

试剂qPCR预混液，体系合格率分别为89.6%，97%及85.7%。QST-103比V品牌的qPCR预混液具有更高的

特异性，可大大降低引物设计要求及工作量。

2. 体系配制速度对引物二聚体影响

a. V品牌预混液和HMOX1基因引物的NTC室温孵育实验

我们从1中对比的67个NTC中，挑选HMOX1基因引物分别和V品牌及QST-100预混液做NTC实验，

并配制好体系后分别室温孵育0h，1h，2h后再进行qPCR扩增。从图a发现，虽然V品牌的NTC体系立即配

制，引物二聚体Cq值仅为37-38左右，但室温孵育1-2小时后二聚体Cq值大幅度下降。而QST-100的NTC

体系即使2小时也不会产生任何二聚体。基因表达分析实验一般配制时间往往1-2h左右，引物二聚体存在

会让数据不可靠风险大大增加。相对于V品牌来说，QST-100的具有更低的配制速度要求。

【存储条件】

本试剂可2-8°C避光保存24个月。

【参考文献】

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