Nature 人类肝细胞图谱揭示细胞异质性与肝上皮前体细胞

       人类肝脏是一种重要的多功能器官。近年来，肝病的发病率正在上升,但可供选择的有效治疗方式仍然十分有限，这背后的原因之一是我们对肝脏的细胞组成仍然缺乏了解。在这里,我们对来自9个人类捐赠者的正常肝脏组织内约10,000个单细胞进行了RNA测序,并构建了人类肝细胞图谱。我们的分析首次揭示了未知的内皮细胞、枯否细胞和肝细胞的亚型。我们证实了EPCAM+ 种群是异质的。EPCAM+ 种群包括肝细胞偏置种群、胆囊素种群以及具有强大双能性肝脏类器官转化潜力的TROP2int 后代群体。作为一项早期实验，我们的细胞图谱揭示了肝细胞癌细胞以及人类肝细胞和肝脏内皮细胞中发生的表型变化，是探究正常和患病的肝脏内未知细胞类型的有效途径。

       作为中央代谢协调器管，肝脏具有多种基本功能，包括调节葡萄糖和脂质代谢、蛋白质合成和胆汁合成。同时,肝脏是一个内脏器官,能够在组织损失后自然再生。然而,近几十年来,肝病的患病率和死亡率明显上升。人类从未在单细胞水平内研究过肝脏全细胞图谱,这限制了我们对肝功能和疾病生物学的分子理解。不过，最近出现的敏感单细胞RNA测序方法使我们能够研究健康和病变组织中的细胞类型。为了在单细胞水平研究人类肝脏细胞多样性，我们开发了一个基于冷冻保存或新鲜分离的人类肝脏样本进行单细胞转录组测序（scRNA-seq）的流程，组建了来自9个人类志愿者的10372个单细胞样本的细胞图谱。我们对所有细胞类型进行了深度分析，分析的侧重点集中在肝上皮前体细胞。

       我们利用mCEL-Seq2对来自九名志愿者的无病变肝脏组织进行了单细胞转录组测序。这些志愿者曾患转移性结直肠癌或胆管癌，但并无慢性肝病史。测序时我们采用了无差别随机选择与按照细胞表明标志物分类测序两种策略。由于新鲜组织量少难保存，我们同时从生物银行取得了一些冷冻保存组织进行测序分析。细胞分类基于RaceID3 完成。从同个病人体内取出的新鲜组织和冷冻组织携带类似的基因标志，但是这些组织的成分略有不同，且不同部位的新鲜组织的细胞成分也并不是完全一致。我们认为，这些不一致是由不同部位组织细胞种类异质性造成的。

       随机选样测序结果鉴定出肝细胞与免疫细胞两大细胞群。在此基础上，我们应用了其他分类策略并分类出内皮细胞（LSECs）和EPCAM+细胞。最终，我们的细胞图谱通过标记物鉴定出各种主要肝脏细胞种类，包括肝细胞，EPCAM+胆管细胞，CLEC4G+肝窦内皮细胞（LSECs），CD34+PECAMhigh大血管内皮细胞（MaVECs）,肝星状细胞，肌成纤维细胞，枯否细胞以及免疫细胞（图一）。

图1. 单细胞转录组测序结果揭示人类肝脏内细胞类型

a, 实验流程；b, 单细胞转录组测序结果t-SNE 图谱；c, t-SNE 图谱中的RaceID3 cluster; d, 标志物基因表达热图。

       肝细胞具有空间异质性，即不同位置的肝细胞间具有一定差异。该异质性可沿肝脏小叶的门静脉区-中央静脉区中轴分带。根据代谢功能，肝脏小叶被分为肝门包围的近门静脉区和靠近中心静脉的中央静脉区，其他区域为中区。虽然其他研究显示LSECs和枯否细胞等非实质细胞有亚型分类，这些细胞的异质性很难说明。并且，多数实验是在啮齿类动物中进行的。本实验直接比对了MaVEC和LSECs的标志物，并鉴定出几个未知的细胞亚群。

       单细胞转录组在小鼠肝细胞分带实验中起到了重要的作用，而人类肝细胞的首个单细胞分析也是近期才完成的。本实验的目的之一是研究沿分带区域的基因表达变化趋势，我们预测基因表达变化与细胞类型的变化是相关的。为了验证这一假说，我们根据Diffusion pseudo-time (DPT)排列细胞并理解为空间分布，并沿此轴应用SOM图来研究基因共表达模式 （图二）。

       我们首先利用小鼠肝细胞分带研究结论来验证了我们的策略。在人类肝细胞中，一系列标志物基因显示出分带区域性表达。例如ALB和PCK1呈门静脉区模式1 表达，CYP1A2和CYP2E1呈表达中央静脉区/中区模式34或24，GLUL为中央静脉区33模式。在我们检验出的3395个基因中，有1384个基因呈现出明显的分带区域性分布。信号通路富集分析显示，肝脏小叶门静脉区富集细胞呈现的高表达基因主要参与氧化生理功能，这与氧气浓度梯度分布一致。肝脏小叶中区的细胞中主要富集的是细胞色素P450共栖代谢的产物,且此发现在蛋白水平得到了验证（图二）。

图2. 肝细胞与内皮细胞的异质性与分带

a,肝细胞分带的SOM与扩散图；b, 内皮细胞分带的SOM与扩散图。

       实验表明，LYVE1和CD14是区分门静脉区LSEC与中区、中央静脉区LSEC的标记物。对于LSEC的分带研究显示，1198个基因中的806个呈明显区域状分布。中央静脉区与中区内皮细胞内高表达基因为LYVE1和FCN3,他们转录翻译出一类纤维胶凝蛋白，它的作用是激活外源凝集素信号通路。信号通路富集分析显示，中央静脉区与中区富集了与清道夫受体-配体结合相关的基因。这些研究结果表明，肝细胞与内皮细胞的基因表达与功能呈分带分布。而人类与小鼠肝细胞分带情况的对比显示其相似性很有限，这代表着进化方向的多样性。

       对CD163/VSIG4 枯否细胞的分析显示一些细胞亚群有着独特的基因表达模式，而枯否细胞与内皮细胞有一些共同的细胞表达与信号通路，这证实了不同细胞类型间或有功能性协作。我们鉴定出两类B细胞，一类是MS4A1与CD37阳性B细胞，它们有着MHC II成分高表达且与循环B细胞相关；另一类为肝内MZB1阳性B细胞，它们的特征是特定性表达DERL3, SSR4与IGHG4。此外,我们鉴定出了CD56阳性NK群以及CD81阳性NKT细胞群，这些细胞内趋化因子配体与颗粒酶等基因的表达量都不相同。这些研究显示，人类肝脏内的免疫细胞亚群也呈现多样性。

       肝脏的损伤修复机制需要完成包括肝细胞、胆管细胞等多种细胞类型的复制增殖。目前，肝内是否存在成熟干细胞以及它对于肝脏损伤修复的作用仍存在争议。EPCAM阳性细胞被一些研究认为是肝干细胞，它们可在人工培养环境下形成高密度圆形集落。此外，它们还是具有双向潜能的前体细胞，可以分化为胆管细胞或肝细胞。

       我们对人类肝脏EPCAM阳性细胞进行了分类和测序，以探究真正的肝脏前体细胞。通过实验我们鉴定出一些与EPCAM或TROP1表达相关的前体细胞表明基因标志物，包括TACSTD2, FGFR2, TM4SF4和CLDN1等。免疫组蛋白染色结果显示，ANXA4是预测性基因标志物，而WWTR1为转录共激活因子。细胞增生标志物MKI67在EPCAM阳性细胞中随机表达。为了研究细胞亚群之间的相关性，我们对EPCAM阳性细胞进行了RaceID3分析，并使用StemID2以及FateID进行线性建模（图三）。结果表明，中心EPCAM阳性细胞会朝着肝细胞与胆管细胞两个方向分化。基因表达分析也得到了一致的结论，一部分细胞内HES1, SFRP5, FGFR2,FGFR3等信号通路成分表达上调，而另一部分细胞亚群含有一套不同的高表达基因。TROP2的表达量与肝细胞分化途径成负相关，其表达量在胆管细胞中较高而在肝细胞相关群体内较低。TROP2的蛋白免疫染色显示其主要在正常人类肝脏的胆管组织表达。将细胞群根据TROP2表达量分为高、中、低三个亚群后可明显观察到细胞群间的异质性。TROP2中表达群往往异质性较强，且含有一个MUC6高表达细胞组。MUC6在胰腺前体细胞中表达量很高且它被认为是肝干细胞的源头。TROP2高表达胆管细胞群含有CXCL8阳性细胞组与MMP7阳性细胞组。相反的，TROP2低表达细胞群内的肝细胞标志物表达量往往较高。

图3. 肝脏内的前体细胞

a, t-SNE map; b, Stem ID2分析；c, FateID 分析，d, 基因表达热图；e, 基因表达线性关系；f,免疫染色结果；g,免疫荧光染色。

       为了验证TROP2中表达细胞群中含有前体细胞，我们利用这些细胞群进行了类器官培养实验。与我们的预测相同，TROP2中表达细胞群显示出最高的类细胞形成潜力，TROP2低表达群无法形成类器官，而TROP2高表达细胞群形成的类器官较小且形成频率较低。以上功能性实验证明了，胆管细胞的一个亚群也许可作为肝前体细胞参与肝脏损伤修复与组织重生（图四）。

图4. TROP2中表达细胞是类器官形成的主要源头

       通过对比健康肝细胞与肝细胞癌中癌变细胞的基因表达情况与蛋白表达情况，我们鉴定出一系列差异性表达的基因。具体来说，癌变细胞中门静脉区缺乏细胞色素P450基因的表达，且代谢相关的标志基因表达也缺失。相反的，已知肝细胞癌标志物AKR1B10在癌变细胞中的表达增高。免疫组蛋白染色显示，与炎症相关的基因也在癌变细胞中高表达 （图五）。

图5. 肝细胞癌中癌变细胞转录组测序结果

       我们通过建立人类肝脏细胞图谱揭示了肝脏内细胞种类异质性，并首次在肝脏内发现一种上皮前体细胞。同时，我们的图谱揭示了全转录组层面的肝细胞与内皮细胞分带分区，这预示着不用细胞种类有着自己特定的功能区域，并会合作完成基础生理功能。虽然我们在蛋白层面验证了自己的假说，此理论还需要大规模基因表达分析的验证。

       EPCAM阳性TROP2中表达细胞群可能是具有分化潜能的前体细胞，他们对肝脏再生、肿瘤发展和疾病病理都有着一定联系。我们的转录组数据与类器官实验都证实了该细胞群有着双向分化潜能；然后，该实验结果还需其他实验的进一步确认。除了提供了完善的转录组图谱我们的实验还验证了类器官与小鼠模型与病人组织的表达相似性，这为以后的肝部基本研究打下了良好的基础。

Reference: Aizarani N, Saviano A, Mailly L, et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors[J]. Nature, 2019: 1.‍

2019年7月发表在Nature上（影响因子43.070）