乳腺癌 (BC) 中肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 的数量是改善患者生存率的一个强有力的预后因素，特别是在三阴性和 HER2-过度表达 BC 亚型中 1。虽然 T 细胞是主要的 TIL 群体 2，但 T 细胞亚群的定量和定性差异与患者预后之间的关系仍然未知。我们对从人 BCs 分离的 6,311 个 T 细胞进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) , 并显示在浸润的 T 细胞群体中存在显著的异质性。我们证明了含有大量 TIL 的 BCs 含有 CD8 + T 细胞，这些 CD8 + T 细胞具有组织驻留记忆 T (TRM) 细胞分化的特征，并且这些 CD8 + TRM 细胞表达高水平的免疫检查点分子和效应蛋白。

图1

图1：原发性与转移性乳腺癌的 TIL 比较，CD8 细胞群表达CD103。收集患者 TIL（n = 129 例独立病例），并使用一组 T 细胞标志物单克隆抗体进行流式细胞术。对活细胞进行 MHC I + CD45 + 细胞 (TIL)、T 细胞 (CD3 +) 和 CD3 + CD4 + 或 CD3 + CD8 + 细胞设门。

a：整个队列原发性和转移性肿瘤（原发性 (P) n = 84，转移性 (M) n = 26，淋巴结转移除外）和根据乳腺癌亚型分组的肿瘤中所有活细胞的TIL百分比：TNBC（原发性n= 29，转移性n= 8），HER2 阳性（HER2，原发性 n = 23，转移性 n = 13）和激素受体阳性（Luminal (Lum)，原发性 n = 32，转移性 n = 5）。

b：表达T细胞检查点 PD-1（所有 n = 70，TNBC n = 24，HER2 n=19，Lum n=27）和 CTLA4（所有 n = 18，TNBC n = 5，HER2 n = 6，Lum n = 7）的CD4和CD8 亚群的患病率。

c：CD3+CD8+ 和CD3 + CD4 + TIL中CD103 的表达（所有 CD8 n = 41，CD4 n = 34；TNBC CD8 n = 15，TNBC CD4 n = 12；HER2 CD8 n = 11，HER2 CD4 n = 9；Lum CD8 n = 15，Lum CD4 n = 13）。

d：CD3+CD8 +CD103 +TIL中的PD-1状态（所有 PD-1 + 和PD-1–n = 30 和 30，TN PD-1 + 和 PD-1–n =10 和10，HER2 PD-1 + 和 PD-1–n=9和9，Lum PD-1 + 和PD-1–n = 11和 11）。

图2

图2：人原代 TNBC 中 6,311 个纯化 CD3 + 单个 T 细胞的单细胞 RNA-seq。

a：人分离 T 细胞的单细胞和 bulk RNA-seq 的工作流程。

b：t-SNE 图，用颜色标界的簇显示 10 个不同的簇，基于 5759 个通过质控的细胞的基因表达差异。括号中的数字对应于 c.

c：单细胞分析经表达恢复 (SAVER) 插补数据中列出的细胞簇（用顶部的彩色条表示）。每个簇的前十个差异表达基因显示在 y 轴上，每个簇的关键基因也显示出来。

d：Volcano 图显示 CD8 + trmlike（两种情况下 n = 685 个细胞）和 TEM 样簇（两种情况下 n = 953 个细胞）之间的关键差异表达基因。P 值是通过使用似然比检验得出的。显示了未校正的 P 值。差异表达基因及相关统计量的完整列表见附表 2，TRM 基因以红色显示，TEM 基因以蓝色显示。

e：显示 5759 个细胞中关键基因表达的特征图。色标表示每个细胞中给定基因的保存者插补基因表达值（log10 刻度）。

f：使用 Monocle 2 算法的单细胞数据中 CD8 + 簇（用彩色圆圈表示）中 n = 2,005 个细胞的 2-D 表示。

图3

图3：使用流式细胞术、bulk RNA-seq、功能研究和 TCR 库表征 CD8 + CD103 + T 细胞。

a：Volcano 图显示根据 CD103 表达在流式分选的 CD8 + T 细胞中显著分化的基因，这些细胞来自 n = 3 个独立的病例（两个原发性肿瘤和一个肝转移）。y 轴上的 P 值来自 limma 实现的经验 Bayes 调节 t 统计（参见方法）。显示了未校正的 P 值。

b：热图比较来自 bulk RNA-seq（CD103 阳性与阴性）和 TRM 簇的基因标签与来自单细胞 RNA-seq 数据的其他 T 细胞。

c：使用来自CD103 + 和CD103 之间差异表达基因的基因集- CD8 + T 细胞在bulk RNA-seq 中，条形码图显示在单细胞TRM 簇和 bulk CD103– 中大量CD8 + CD103 + 'UP' 基因显著富集。单细胞 TEM 集群中的“向上”基因（来自 limma 的预先确定的竞争性基因集测试）。在 x 轴上的统计量是 gress 中的基因 wise z 评分统计量，垂直条代表基因集中每个基因的统计量。

d：根据 n = 5 例 TNBC 患者的体外功能数据确定 CD8 + CD103 + T 细胞中颗粒酶 B (GZMB) 的表达。条形图表示平均值，误差线表示 s.e.m.。采用双侧 Wilcoxon 秩和检验进行统计分析。

e：CD8 + CD103 + T 细胞与CD8 + CD103-之间克隆型的比较原发性肿瘤和肝转移中的 T 细胞。原发性肿瘤的 TCR 谱系没有重叠。重叠的克隆用箭头标记肝转移。为明确起见，排除患病率 < 0.5% 的克隆型。

图4

图4：来自人类早期 TNBC 单细胞数据的 TRM CD8 + 基因标记的优越预后能力。

a,b：Kaplan–Meier 生存曲线显示 329 例原发性基底细胞样/TNBCs 的无瘤生存率 (a) 和总生存率 (b)，根据单细胞数据得到的 TRM 基因标签显示显著的预后分离。

c、d：无病 (c) 和总 (d) 生存期，使用 CD8A 表达对病例进行分层

从 scRNA-seq 数据中开发的 CD8 + TRM 基因标记与早期三阴性乳腺癌 (TNBC) 患者生存率的改善显著相关，并提供了比单独 CD8 表达更好的预后。我们的数据表明，CD8 + TRM 细胞有助于 BC 免疫监视，并且是免疫检查点抑制调节的关键靶标。进一步了解 TRM 细胞的发育、维持和调控将对 BC 免疫治疗的成功发展至关重要。

DOI：10.1038/s41591-018-0078-7

Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset associated with improved prognosis

参考文献

[1].Savas, P. et al. Clinical relevance of host immunity in breast cancer: from   TILs to the clinic. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 228–241 (2016).

[2].Rufell, B. et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. Natl   Acad. Sci. USA 109, 2796–2801 (2012).

[3].Adams, S. et al. Phase 2 study of pembrolizumab (pembro) monotherapy for   previously treated metastatic triple-negative breast cancer (mTNBC):   KEYNOTE-086 cohort A. J. Clin. Oncol. 35 no. 15_suppl, 1008 (2017).   

[4].Schmid, P. et al. Atezolizumab in metastatic TNBC (mTNBC): long-term   clinical outcomes and biomarker analyses. Cancer Res. 77, 2986 (2017).

转自纽创医学Bio-SCI