TP63异构体表达与癌症不同临床结果的关联

TP63 isoform expression is linked with distinct clinical outcomes in cancer6.68

EBioMedicine. 2020 Jan; 51: 102561.

Published online 2020 Jan 9. doi: 10.1016/j.ebiom.2019.11.022

Abstract

Keywords: TP63, Isoforms, Cancer, Bladder Cancer, Biomarker

素有“基因组卫士”之称的抑癌基因TP53在调控细胞周期、细胞凋亡和维持基因组稳定过程中的重要性，相信大家是早就熟知了的。今天，小编跟大家分享的这篇文章是关于它的家族成员TP63的，TP63有多种异构体(即基因的可变剪接产生不同的转录本)，这些异构体根据其N端转录起点的不同分为两种：较长TA异构体和较短DN异构体(DNp63和TAp63)。TA异构体能抑制细胞的无限增殖，而DN异构体则会促进细胞的生长和迁移，并可以拮抗TP53蛋白和TA异构体的功能。

目前，已知TP63在人类膀胱癌中是普遍表达的，这篇文章就利用TCGA中的数据综合分析了TP63异构体的表达及其与膀胱癌和其他人类癌症的关系。该研究发现，DNp63异构体在癌症中表达最普遍，其高表达通常预示着较好的结果，而TAp63的表达则与较差的临床结果相关。下面，咱们详细看一下作者的分析流程和研究结果。

数据和方法

数据获取与处理

作者首先下载了TCGA中29种疾病的双端RNA测序数据(删除了4种数据集为单端测序的疾病)以及病人的临床数据；然后将膀胱尿路上皮癌(BLCA)数据读段通过STARv2.5.2比对到hg38参考基因组，并用Cufflinksv2.2.1识别潜在的TP63新异构体；同时，对所有29种疾病的测序数据用Salmonv0.11.3进行比对和量化(校正序列、GC和位置偏差)；TPM值的标准化方法为上四分位数，z-score值用log2 TPM计算所得；最后，对于每位患者，通过将某一种特定异构体的所有转录信号进行加和来构建TP63异构体分组。

统计方法

数据的统计分析和可视化都是基于R完成的。首先，作者用Cox比例风险回归模型分析了TP63基因以及异构体的表达同TCGA泛癌数据集中患者的生存之间的关系；然后，通过计算患者群体表达值的五个阈值：第5、10、50、90和95百分位数，患者被分为高、低TP63基因及异构体表达组，并利用KM图进行可视化。

作者通过一个加权模型从GSEA提供的基因集数据库MSigDB中下载了v6版基因集，并用Wilcoxon检验所得的-log10p将基因做了排秩，以量化患者基因表达的差异性。FDR<=0.05的基因集认为是显著的，此外，作者还从HPRD数据库获取了蛋白互作数据。

cDNA提取及其他分析

文章使用到的膀胱癌细胞系有253J，UM-UC5，UM-UC14，UM-UC13和UM-UC10，作者最终获得了它们的RNA。并且，对于未注释的TP63异构体，作者还做了PCR验证以及免疫印迹，该过程小编就不在此赘述了。

结果

TP63基因在泛癌中的表达及与生存的关系

作者将29种疾病，总计8519名患者的RNA-Seq和临床数据进行了标准化处理，以综合分析TP63基因的表达同患者结果之间的关系。跟已有的研究结果一致，作者发现在鳞状组织学相关癌症中(宫颈癌、肺鳞癌等)，TP63均表现出高表达，在膀胱癌中其次(图1.a)。通过Cox回归分析，研究发现TP63较高水平的表达与胶质瘤、皮肤黑色素瘤和胰腺癌生存变短显著相关，而在乳腺癌、肺鳞癌和膀胱癌中情况则相反(图1.b)。在BLCA样本集中，TP63的表达是双峰的，大部分是高表达(图1.c)，而且这些高表达的患者，他们的平均总生存期(OS)显著高于低表达患者(图1.d)。

图1. TP63表达的泛癌分析

膀胱癌中TP63异构体的识别

基于已有研究，作者假设TP63的差异效应可能与TP63异构体表达的多样性有关。为了构建一个比较全面的TP63异构体集合，作者从Refgene和Gencode数据库获得了相关的注释信息(共挖掘出13种TP63异构体)；并用de novo异构体挖掘方法识别了未注释的TP63异构体(基于Cufflinks)：DNp63alphaP和DNp63betaP，作者通过PCR证实了它们在膀胱癌中的表达，因此，最终确定了15种TP63异构体(图2)。

图2. 膀胱癌中TP63异构体的识别

TP63异构体表达的量化

作者用Salmon方法将单个亚型在膀胱癌以及其他癌症中的表达进行了量化。在膀胱癌中，多数为DNp63组的异构体(图3.a)，在一组独立的原发性膀胱癌样本集和膀胱癌细胞系中，作者也观察到了相似的表达模式(图3.b-c)，而且在这三组数据集中，DNp63alpha和DNp63beta要稍稍高于其他亚型。在其他癌症中，TP63异构体具有类似的表达模式，表明了这种量化的非特异性。接下来，作者又分别用定量PCR和实时定量PCR证实了Salmon量化方法可以准确反应TP63异构体的相对表达、准确定量alpha, beta和delta TP63的比例，并一致发现alpha最丰富(图3.d-g)。

该研究对所有TP63和TP63的alpha异构体做了免疫印迹，以比较蛋白质和mRNA水平的表达是否相似(图3.h)，同作者预期的一样，所有条带都对应着DNp63亚型(图3.b)。在UM-UC5和UC14细胞系中，DNP63α异构体的表达定量分别占总TP63 mRNA的90%和91%，蛋白表达定量也分别占了84%和80%。这些结果证实了用Salmon定量可以准确预测TP63异构体的表达，并且DNp63α是膀胱癌中最主要的TP63异构体。在TCGA中的其他肿瘤中，大多数具有一样的TP63异构体图谱(图3.i)。

图3. TP63异构体表达的量化

膀胱癌亚型中的TP63异构体表达

为了确定TP63异构体的表达在膀胱癌各分子亚型中是否不同，作者分析了TP63在基底鳞状、官腔乳突状、管腔浸润、管腔和神经内分泌这五种亚型中的表达(图4.a)。结果发现DNp63组在基底鳞状以及官腔乳突状亚型中的表达要高于其他三种(图4.b)，而且基底组患者的TAp63表达明显高于官腔患者(图4.c)，这表明了DNp63和TAp63在TCGA分子亚型中可能具有不同的表达水平。

图4.膀胱癌分子亚型中TP63异构体的表达

然后，作者又分析了单个TP63异构体与患者生存之间的关系，并对DNp63和TAp63做了比较。BLCA DNp63阳性和阴性组的KM生存曲线表明阳性组患者的总生存期要高于阴性组；而且，DNp63alphaP阳性组患者的总体生存率也有所提高(图5.a)，在BRCA和LUSC数据集中也获得了相似的结果。

根据TAp63异构体表达的有无将患者分为两组后，作者发现TAp63或TAp63beta高表达的患者其OS显著低于无/低表达患者(图2.b)，BRCA和LUSC数据集中同样观察到了相似的结果。前面咱们已经说过，TP63基因表达与存活的关系和膀胱癌分子亚型有关，类似地，DNp63表达与官腔患者的风险降低显著相关，而TAp63则与基底鳞状亚型患者的危险增加显著关联(图5.c)。多变量Cox回归分析的结果表明，临床因素中只有年龄以及病理分期与生存有关，在控制这两个变量时，DNp63的高表达依旧与生存率的提高有关，而且TAp63的高表达也同样与死亡风险的增加显著相关(图5.d)，这表明了DNp63和TAp63的表达作为膀胱癌独立预后因子的可能性。

图5. TP63异构体的表达与生存相关

接下来，作者又对整个TCGA泛癌群体做了单变量Cox比例风险回归分析，发现了DNp63与BRCA、BLCA和LUSC的HR增加之间的关联，证实了上面的结果。由于DNp63和TAp63表达与生存的关系是相反的，因此研究假设TP63与HR的关联可能是由这两种异构体相对丰度的变化决定的。作者将整个TCGA肿瘤群体进行了分组(图6.c-d)，由图可知，具有较高TP63相关风险的患者，具有较低的DNp63比例以及较高的TAp63比例。

图6. DNp63和TAp63与生存的关系

DNp63和TAp63异构体相关的信号通路

已有研究表明DNp63和TAp63可以促进预后相关的转录过程，因此，作者使用五分位数法，基于DNp63和TAp63的表达水平分别将BLCA，BRCA和LUSC患者进行分层。然后用符号Wilcoxon p值对基因进行排秩做GSEA，识别出在每个异构体表达水平较高的组中显著富集的基因集。由图7的富集结果，可知高水平DNp63的患者富集到了表皮细胞分化、角化和皮肤发育相关的基因，TAp63则富集到了与适应性和先天免疫反应、VEGF信号、Jak-Stat信号和其他几种转录因子相关的基因集，这意味着DNp63和TAp63与不同的转录和信号通路有关。

图7. 基因富集分析

总的来说，作者挖掘出了15种TP63异构体，比较了它们在膀胱癌各亚型中的表达水平，并对TAp63和DNp63异构体做了生存分析以及富集分析，发现了它们与患者生存期之间的关系是相反的，其富集的生物学过程也是不同的。这篇文章的创新之处在于首次对TP53异构体表达进行了泛癌分析，但是用到的生物信息学方法都比较简单，也没什么太多的套路，希望大家看完能有所收获。