small RNA 测序

mall RNA（包括 miRNAs、siRNAs 和 piRNAs 等）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢紊乱及疾病发生和发展等生理过程中发挥重要作用。miRNA 是一类内源性的、长度约 18-25 nt、具有调控功能的非编码 RNA，通过和靶基因碱基配对引导沉默复合体降解 mRNA 或阻碍其翻译。Small RNA 测序技术不受物种限制，既能鉴定特定条件下表达的 miRNA，又能预测发现新的 miRNA，对于疾病的发生发展研究有重要意义。

高度灵活性
可研究任一 17-35 nt 之间的小 RNA 分子
高度准确性
可准确到单核苷酸水平，有利于区分高度同源的小 RNA 分子和鉴定小 RNA 的多态性
检测动力学范围广
可在超过 6 个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析，有利于低丰度小 RNA 差异表达的研究
数据质量高
深度测序保证了抽样随机性、可靠性和重复性，与实时定量 PCR 结果具有较高的一致性
推荐测序模式
●   Hiseq X Ten, PE150    ●   10 M 或 20 M clean reads/样本
案例展示
案例一   轮状病毒编码的病毒样 small RNA 通过 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向 IGF1R 触发宿主细胞自噬
研究背景
轮状病毒是双链 RNA 病毒，它是婴儿病毒性腹泻的主要原因。病毒可以创造一个微环境，通过编码 miRNA 等靶向调控各种宿主细胞的分子来促进其生存和自我增殖。然而，RNA 病毒是否编码 miRNAs 以及其调控机制仍有待于探究。
研究内容
我们携手中国医学科学院医学生物学研究所，发现轮状病毒（Rotavirus， RV）编码的 small RNA RV-vsRNA1755 可以通过 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向调控 IGF1R 触发宿主细胞自噬。通过 small RNA 测序分析确定研究对象 RV-vsR-NA1755，发现 RV 感染初期其通过靶向调控 IGF1R 导致 PI3K/Akt/mTOR 通路受到抑制，并触发了细胞自噬，但最终会抑制自噬体的成熟。

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研究结果
1. small RNA 测序发现，Chr17_1755 在 RNV 感染后表达量显著性升高，因此 Chr17_1755 可能是 RV 负责编码的 small RNA。
2. 通过 mirdeep2 预测 Chr17_1755 前体序列并将 PCR 产物与 RV NSP4 基因组比对，确定 RV-vsRNA1755 (Chr17_1755) 来自于 RV，且由 NSP4 编码。
3. 通过 miRanda 靶基因预测、荧光素酶报告实验、qRT-PCR 和 WB 等确定 RV-vsRNA1755 调控 PI3K/Akt 通路中 IGF1R 的表达。
4. 对不同感染阶段 Akt 和 mTOR 的磷酸化水平进行检测发现，在 RV 感染初期，PI3K/Akt/mTOR 通路被抑制，检测细胞自噬水平发现 RV 感染引起细胞自噬。
5. 过表达 RV-vsRNA1755 和沉默 IGF1R 均发现促进了 LC3II 的形成和 P62 的降解，同时细胞自噬水平升高。
参考文献
Zhou Y, Geng P, Liu Y, et al. Rotavirus-encoded virus-like small RNA triggers autophagy by targeting IGF1R via the PI3K/Akt/mTOR pathway. BBA-Mol Basis Dis 2018; 1864(1): 60-68. (IF: 5.476)
常见问题
1. small RNA 测序后进行 RT-PCR 验证时，常会出现非特异性扩增，如何解决？
因为 miRNA 序列比较短，彼此间相似度又非常高，尤其是同一家族的 miRNAs，彼此间可能只有 1 个碱基差异，出现非特异性扩增是很正常的，建议使用 Taqman 探针法进行尝试。
2. 没有参考基因组可否进行 small RNA 测序？
进行生物信息分析时，针对有参考基因组样本，以该物种的基因组以及该物种的 miRBase 数据库为参照进行数据分析；如果没有参考基因组，可以近缘物种的基因组以及近缘物种的 miRBase 数据库为参考，或者动物样本以所有动物的 miRBase 数据库、植物样本以所以植物的 miRBase 数据库为参照进行比对分析。
3. small RNA 测序对样本有什么特殊要求？
为防止 small RNA 丢失，浪费样本、时间和精力，抽提 total RNA 时请使用 miRNA Homogenate Additive。如果同一份样本同时检测 mRNA/lncRNA 和 small RNA，请事先告知该区域负责的销售工程师，请公司抽提人员注意保留 small RNA。
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