外泌体专题｜Olink 超灵敏蛋白质组学加速神经领域无创型蛋白标志物开发

在中枢神经系统原发恶性肿瘤中，脑胶质瘤最为常见原发性脑肿瘤，其诊断和治疗也最具挑战性的癌症形式之一。按肿瘤细胞的恶性程度划分：低级别胶质瘤（WHO I和II级），为预后良好的胶质瘤，高级别胶质瘤（WHO III和IV 级），这类肿瘤为恶性肿瘤，预后较差。这类肿瘤良恶性区分，诊断要依赖于手术后的病理诊断，目前依赖于活检或肿瘤切除后获得的组织样本。然而，因为病理诊断手术后并发症（如神经损伤、出血、感染）的风险相当大，使得脑肿瘤是最难以进行活检诊断的肿瘤之一。从而导致肿瘤治疗延迟，并最终导致糟糕的患者结局。已有研究表明，早期发现与诊断脑胶质瘤是提高胶质瘤病人预后的核心环节。因此寻找脑胶质瘤早期诊断、疗效评价及判断预后的指标至关重要。

细胞外囊泡作为一种潜在的液体活检生物标志物受到了广泛关注，因为它们代表了「细胞起源的缩影」。来自瑞典隆德大学的研究者使用了尺寸排阻色谱法（SEC）、以及超灵敏的邻位延伸分析技术对脑肿瘤患者群体队列进行研究，寻找肿瘤来源的血浆外囊泡（plEV）蛋白生物标志物，用于良恶性胶质瘤的区分。通过对136例患者在基线（术前）和术后3周（术后），肿瘤治疗开始前采集纵向血浆样本。该队列包括疑似脑肿瘤病变患者（n=136），根据临床常规通过手术和组织病理学检查确定，其中69例患者被诊断为恶性（WHO IV）GBM, 17例患者被诊断为低级别良性（WHO II）星形细胞瘤（以下简称LGG）。

通过使用SEC从所有患者中分离plEV，并使用基于PEA技术的超灵敏分析技术对蛋白质组进行检测。研究者同时分析检测了Olink Target 96 oncology II以及CVDIII两个panel中183个蛋白，检测panel是根据已知参与胶质瘤生物学或潜在的外囊泡分类而选择的。使用线性回归并校正年龄（GBM和LGG组之间没有性别差异），共有12个plEV相关蛋白在GBM和LGG组之间存在显著差异（P < 0.05），其中一半在98%以上的plEV样本中检出。在调整多次检测时，特别是syndecan-1 （SDC1）在GBM和LGG之间差异显著，而integrin beta chain-2 （ITGB2）表现出强烈的趋势，但不显著。值得注意的是，SDC1和ITGB2是单通道I型膜蛋白，这表明它们是潜在的EV表面生物标志物。

为了探讨plEV诊断的准确性，研究者进一步建立了ROC曲线。ROC分析显示，血浆EV-SDC1 （plEV SDC1）可区分GBM和LGG患者，其AUC值为0.81 （95% CI: 0.69-0.93），敏感性为71% （95% CI: 44%-89%)，特异性为91% （95% CI: 81%-97%）。血浆EV-ITGB2 （plEV ITGB2）的AUC为0.77 （95% CI: 0.65-0.88）的敏感性为65% （95% CI: 38%-86%），特异性为71% （95% CI: 58%-81%）。

研究者进一步通过定量免疫ELISA分析来验证来自PEA检测的神经胶质瘤队列中的plEV SDC1数据。基于ELISA方法的plEV SDC1定量检测可以区分GBM和LGG患者，但是 ELISA的灵敏度低于PEA。为了进一步探索plEV SDC1的来源是否是GMB细胞，研究者匹配来自plEV SDC1低、中、高的患者的肿瘤，SDC1在配对plEV中的表达与肿瘤样本密切相关。研究者观察到plEV SDC1低水平患者几乎没有染色，而plEV SDC1中高水平患者的肿瘤信号有限且强烈。为了进一步研究plEV SDC1水平与肿瘤状态之间的相关性，在开始肿瘤治疗前的术前和术后21天对GBM患者的plEVSDC1进行了评估（n=15）。总体而言，结果显示术后plEV SDC1显著下降。该研究支持了循环血浆外囊泡plEVs作为胶质瘤非侵入性诊断和监测工具的可能性，该应用有望进一步改善癌症患者早期诊断。

在缺乏抗病毒治疗的情况下，大量艾滋患者可能会经历严重的认知障碍，这是由于长期的艾滋病毒感染对大脑的损害造成的，这被称为艾滋病毒相关的神经认知障碍 （HAND） 。尽管进行了有效的抗逆转录病毒治疗，艾滋病毒感染患者的认知障碍仍然存在。诊断和监测艾滋病毒相关的神经认知障碍 （HAND）需要专门的神经心理测试。虽然脑脊液 （CSF） 被认为是最接近神经病理学的，但它需要一个侵入性的过程。为HAND找到一种便宜、客观、无创的生物标志物不仅有助于诊断，而且有助于监测治疗或治愈后神经元健康的潜在恢复。

来自加州大学旧金山分校医学实验室和医学院的科研人员，利用神经元特异性细胞表面抗体L1细胞粘附分子从血浆中分离出神经元来源的外泌体 （NDEs）。对来自通过血浆中的神经元外泌体发现HAND认知障碍的生物标志物。使用Olink Target 96 Neurology 以及Neuro Exploratory panel 对 80份来自血浆样本的NDEs进行检测。该队列包括男性（n=29）和女性（n=51），根据HIV以及认知状态，分成四组，包括HIV阴性神经心理正常（NPN），HIV阳性NPN，HIV阳性无症状神经认知障碍（ANI）以及HIV阳性轻度神经认知障碍（MND）。

PEA邻近延伸分析显示，HIV未感染认知正常NPN 与HIV感染后认知正常人相比，有25个蛋白差异表达。图中显示了7种最显著的蛋白，包括ezrin （EZR） (P = 0.0002)、galectin 8 （P = 0.0002）、LDL受体相关蛋白1 （P = 0.0002)、原蛋白（P = 0.0004）、排斥引导分子A （P = 0.0004）、清道夫受体A类成员5 （P = 0.0004）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体R3 （P = 0.0004）。

进一步的结果显示，男性和女性的NDE结果有显著差异。在认知受损男性的NDE中，High mobility group box 1和neurofilament light显著增加，而在女性中没有变化。HIV阳性男性的NDE降低了p-T181-tau蛋白，而这是阿尔茨海默病增加的一种标志物，而女性则没有差异。NDE β淀粉样蛋白在认知障碍中没有增加。在HIV阳性的妇女中，有7种蛋白质被鉴定为无症状和轻微的认知障碍。在轻度损伤中，妇女的NDE显著降低组织蛋白酶S、总tau蛋白、神经元细胞粘附分子和接触蛋白5。认知受损男性的NDE中有12种蛋白升高，包括羧肽酶M、钙粘蛋白3、集落刺激因子2受体α亚基和中脑星形细胞源性神经营养因子。这些差异可能与下丘脑-垂体-肾上腺轴或应激、雌激素水平、抑郁、药物滥用和其他合并症有关，也可能与阿尔茨海默病中所见的性别差异一致。

研究者发现血浆NDE可以识别HIV感染的神经元功能障碍，并区分病毒抑制男性和女性的认知障碍。认知损伤的血浆生物标志物提供了一种更快速、廉价、无创的方法来评估随着时间推移的损伤，并监测治疗的变化。

参考文献：

1. Ultrasensitive Immunoprofiling of Plasma Extracellular Vesicles Identifies Syndecan-1 as a Potential Tool for Minimally Invasive Diagnosis of Glioma. Clin Cancer Res. 2019. 25(10).（案例一）

2. Profile of neuronal exosomes in HIV cognitive impairment exposes sex differences. AIDS 2019. 33:1683–1692. （案例二）

3. Snail regulates BMP and TGFβ pathways to control the differentiation status of glioma-initiating cells. Oncogene. 2018. volume 37, pages 2515–2531.（超离心制备)