文献解析|小分子靶点发现技术在普洛沙星药物抑制前列腺癌转移研究中的应用

骨是前列腺癌(PCa)最常见的转移部位。PCa 侵袭导致成骨-溶骨性平衡的破坏并导致骨形成异常。PCa与骨基质细胞，尤其是成骨细胞(OB)之间的相互作用被认为对于疾病进展至关重要。然而，有效阻断癌-骨相互作用和调节成骨-溶骨平衡的药物仍未被发现。

构建报告基因系统，从631个化合物中筛选出抑制PCa诱导的OB激活的化合物。然后，在细胞模型中研究了候选药物Procoxacin(Pro)对 OB、破骨细胞 (OC) 和癌-骨相互作用的药理作用。胫骨内接种、显微CT和组织学分析用于探讨Pro对成骨和溶骨性转移性病变的影响。生物信息学分析和实验，包括qPCR、蛋白质印迹和ELISA 测定，用于鉴定癌骨微环境中Pro的效应分子。利用虚拟筛选、分子对接、表面等离子体共振分析和RNA敲低来鉴定Pro的药物靶点。进行了包括 co-IP、蛋白质印迹和免疫荧光在内的实验，以揭示Pro与其靶标结合的作用。采用心内接种转移模型和生存分析来研究Pro对转移癌的治疗效果。

由Runx2结合序列、OSE2和Alp启动子组成的荧光素酶报告基因能够灵敏地反映PCa-OB相互作用的强度。Pro最符合药物筛选中 631 种化合物的筛选标准。进一步的研究表明，Pro可有效抑制PCa诱导的成骨细胞变化，而不会杀死 OB或PCa细胞，并在极低浓度下直接杀死 OCs 或抑制破骨细胞功能。为了确认 Pro 与 14–3-3ζ 的结合，作者在 C4-2B 细胞中进行了磁珠捕获实验。在 Pro 结合的磁珠（P Beads）组中观察到了一个较弱的14–3-3ζ条带，而在空白磁珠（E Bead，阴性对照）组中没有观察到条带。此研究应用了小分子靶点发掘技术，对Pro的药效机制研究具有重要的意义。机制研究表明，Pro 通过夹入14–3-3ζ/Craf复合物并阻止其解离，打破了TGF-β/C-Raf/MAPK 通路的反馈回路。Pro 治疗减轻了PCa相关的骨骼中的成骨和溶骨性病变，并减少了PCa体内转移量。

此研究提供了一种基于癌症宿主微环境的药物筛选策略，并证明 Pro 可有效抑制 PCa相关骨中的成骨细胞和破骨细胞病变，这使其成为 PCa 骨转移的有前途的治疗药物。

1.1 构建PCa-OB相互作用报告基因系统、PCa诱导的OB活化的高通量筛选、评估Procoxacin作为骨转移候选药物

1.1.1构建PCa-OB相互作用报告基因系统

鉴于前列腺癌的骨转移是骨生成性的，且OC抑制不能抑制癌症进展，作者决定将PCa-OB相互作用作为药物筛选的目标。作者首先检查了OB培养物中是否存在PCa细胞时几个重要的成骨细胞基因的表达情况。在基础培养基或促成骨培养基（PM）中培养的成骨细胞系MC3T3-E1中检测了Runx2、Ocn、Col1a1、Opn和Alp的转录水平，并与来源于骨的小鼠前列腺癌细胞系C4-2B一起培养。在PM培养的MC3T3-E1细胞中，Alp的mRNA水平显著增加，并在第10天达到峰值，相较于第0天有明显提高。此外，添加C4-2B细胞后，Alp的升高更为显著。相反，Ocn的mRNA水平在第7天之前保持不变，并在第10天后开始增加。如图1A和1B所示，合作培养的MC3T3-E1细胞中Runx2、Opn和Col1a1的表达在7天内没有显著升高。因此，作者将Alp作为报告基因，并将小鼠Alp启动子序列引入到荧光素酶基因的启动子区域。此外，尽管Runx2的mRNA水平没有增加，但Runx2转录调控的基因，如Ocn和Opn，则上调表达。因此，根据Patricia和Yang的协议，作者在上游克隆了6个Runx2结合序列（成骨细胞特异性顺反元件，OSE2）。OSE2序列与Alp启动子的组合在作者的研究中被称为骨发生响应元件（ORE），并且将报告基因稳定转染到MC3T3-E1细胞中建立了MC3T3-ORE细胞。由于MC3T3-ORE细胞数量也影响总体荧光素酶活性，作者将绿色荧光蛋白（GFP）转染到MC3T3-ORE细胞中作为内部参考。然后，作者验证了报告基因系统的可靠性。将MC3T3-ORE（1,000个细胞）与不同比例的C4-2B细胞共培养在PM中。在共培养48小时后检测到荧光素酶活性（Luc）和绿色荧光（GF）。如图1C所示，随着C4-2B细胞数量的增加，归一化的荧光素酶活性（Luc/GF）也增加。

1.1.2 PCa诱导的OB活化的高通量筛选

在筛选包含631种天然化合物的库之前，为了评估每种化合物对癌细胞存活的影响，将红色荧光蛋白（RFP）稳定转染到C4-2B细胞中（C4-2BRFP）。如图1D所示，绿色荧光强度表示MC3T3-ORE细胞的数量；红色荧光强度表示C4-2B-RFP细胞的数量；琼脂素发光强度表示MC3T3-ORE细胞的成骨活性。将MC3T3-ORE和C4-2B-RFP细胞按1：2的比例混合，在PM中共培养。6小时后，将化合物加入培养基，最终浓度为2μM。24小时后，从每个孔收集绿色荧光、红色荧光和发光信号，并通过归一化到对照孔（表S2）计算相对绿色荧光强度（RGI）、相对红色荧光强度（RRI）和相对荧光素酶发光强度（RLI）。将每种化合物对RGI、RRI和RLI的影响显示在三维坐标系中，并投影到二维坐标系中（图1E）。作者用橙色、红色和绿色分别突出显示下调RLI和RRI、对RGI没有影响的化合物（图1F）。通过交叉这三组，找到了17种化合物（详细信息见表1），如Venn图所示（图1G）。这17种化合物被认为能有效抑制PCa诱导的OB活化和PCa的存活，而不对OB产生细胞毒性。值得注意的是，AICAR（磷酸盐）（AIC）和Procoxacin（Pro）可将RLI降低约50%。此外，Ursonic acid和Ginsenoside Rg2（Gin）能够减少45%的RRI，具有强烈的抗肿瘤作用。

1.1.3 评估Procoxacin作为骨转移候选药物

在这17种化合物中，选择了7种RLI抑制率大于20%的化合物进行进一步验证。如图1H所示，Pro（2μM，48小时）对荧光素酶报告基因的表达具有最佳的抑制效果。一致地，在与C4-2B共培养的MC3T3-E1细胞中，Pro处理组的Alp表达最低（图1I）。CCK-8实验（48小时）证实这些化合物对成骨细胞系MC3T3-E1（图S1D）和C3H10T1/2（图S1E）的存活率几乎没有影响，但抑制了来源于骨的PCa细胞系C4-2B（图S1F）和PC-3（图S1G）的存活率。综上所述，作者确定Pro是最佳的抑制剂，能够抑制PCa诱导的OB活化，而不影响OB的存活，这意味着Pro可能以最小的副作用抑制骨髓中的正常干细胞，从而抑制骨转移的生成。

1.2 Procoxacin对OB活性的影响

以上结果表明，浓度为2μM的Procoxacin对降低前列腺癌细胞具有有效作用。因此，Procoxacin对前列腺癌与OB相互作用的抑制效果可能是由于前列腺癌细胞减少所致。然而，根据化合物筛选的数据，仅有57个抑制前列腺癌的化合物可以抑制前列腺癌诱导的OB活化（图S2A）。这表明Procoxacin对OB活化的抑制效果背后可能存在其他机制。为避免在共培养系统中减少前列腺癌细胞，作者首先测试了Procoxacin在C4-2B细胞中的细胞毒性，并发现浓度低于400 nM的Procoxacin不会抑制C4-2B细胞的存活率（图S2B）。然后，作者调查了Procoxacin在OB中的安全浓度。结果显示，Procoxacin在成骨细胞系MC3T3-E1、C3H10T1/2和原代小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）等成骨细胞中具有较宽的安全浓度范围，如图2A所示。因此，在接下来的研究中，作者使用最大浓度为400 nM的Procoxacin。接下来，作者证明Procoxacin对直接在PM中培养的MC3T3-ORE细胞的活化几乎没有影响（图2B）。在转录水平上，Procoxacin（400 nM）对碱性磷酸酶（Alp）、Runx2、Ocn和Opn等成骨基因没有显著的抑制作用，反而促进了在无PM培养的MC3T3-E1细胞中Ocn和Opn的表达（图2C）。一致地，Alizarin Red S染色结果显示，Procoxacin（100和400 nM）对在PM中直接培养的MC3T3-E1细胞的钙沉积能力几乎没有影响，如图2D所示，并在图S3A中进行了定量分析。鉴于Procoxacin对直接培养的OB没有明显影响，作者推测Procoxacin对成骨活性的影响与癌细胞有关。如图2E所示，并在图S3B中进行了定量分析，浓度低至100 nM的Procoxacin可以抑制与C4-2B细胞共培养的MC3T3-E1细胞在PM中的钙沉积。类似地，浓度高于50 nM的Procoxacin显著抑制了与C4-2B细胞在PM中共培养的MC3T3-ORE细胞的活化（图2F）。

1.3 Procoxacin对OC活性的影响

作者进一步研究了Procoxacin对OC的影响。CCK-8实验显示，包括U937、RAW264.7和原代骨髓巨噬细胞（BMMs）在内的前成骨细胞受到Procoxacin的明显抑制，其48小时的IC50值分别为0.87μM，1.57μM和0.23μM（图3A）。TRAP染色的OC分化实验显示，浓度低至5 nM的Procoxacin显著减少了TRAP阳性多核OC的数量和面积（图3B）。与之一致地，在模拟骨的羟基磷灰石涂层基质板上，OC对骨吸收能力随着Procoxacin剂量的增加而降低，如图3C所示。同时，Procoxacin有效抑制了多个与成骨细胞成熟和功能相关的重要基因的表达，但对OC的主要调节转录因子Nfatc1的表达影响较小（图3D）。这些结果表明，Procoxacin是OC存活和功能的强效抑制剂。

1.4 Procoxacin在PCa骨转移的治疗效果

为了研究Procoxacin是否能治疗体内的PCa骨转移，作者使用两种来源于骨髓的PCa细胞系C4-2B和PC-3建立了胫骨内接种的小鼠模型。如图4A和B所示，Procoxacin显著减少了接种C4-2B或PC-3细胞的裸鼠的肿瘤负担。微CT和组织学分析显示，C4-2B细胞在骨髓中引起异常骨形成，而Procoxacin明显抑制了这一现象（图4C和D）。相反，PC-3细胞引起明显的骨破坏，而Procoxacin也能改善此情况（图4E和F）。为了区分癌细胞和骨间质细胞，作者对CK8/18进行了染色（图S4A）。作者还观察到，在对照组的一些小鼠中，癌细胞破坏了骨皮质并侵入非骨骼组织（图S4B）。图4G和H分别显示了C4-2B和PC-3相关骨骼中经过Procoxacin处理与否的梁状骨的典型图像。此外，Procoxacin显著降低了C4-2B相关骨骼的百分比骨体积（骨体积/总体积，BV/TV），梁状骨厚度（Tb.Th）和梁状骨数量（Tb.N），而梁间距（Tb.Sp）的差异很小（图4I）。在受PC-3细胞侵犯的胫骨中，所有参数在Procoxacin治疗下显著改善（图4J）。C4-2B相关骨骼的Alp染色和PC-3相关骨骼的TRAP染色显示，Procoxacin在体内抑制了骨形成和骨吸收的活性（图4K和L）。

1.5 Procoxacin通过降低癌细胞源性TGF-β1来抑制PCa诱导的OB活化

本研究结果显示，Procoxacin直接抑制了OCs，这可能很好地解释了Procoxacin对体内骨转移的抑制作用。然而，目前尚不清楚Procoxacin如何阻断PCa诱导的OB活化。为了回答这个问题，作者分析了Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中编号为GSE22813的数据集，其中将C4-2B细胞注射到小鼠胫骨中，并获取了肿瘤相关骨骼中基质细胞的转录组。通过将C4-2B相关骨骼与假手术骨骼和完整骨骼进行比较，作者发现TGF-β信号通路（图5A）和Tgfb2的转录（图5B）在骨基质细胞中被C4-2B细胞显著激活。WB验证了C4-2B在第7天时诱导MC3T3-E1细胞中TGF-β2的表达（图5C）。然而，ELISA检测显示，Procoxacin处理并没有明显降低共培养上清液中TGF-β2的浓度，约为15 ng/ml（图5D）。此外，WB显示了MC3T3-E1细胞中TGF-β2表达的类似结果（图S5）。

考虑到Procoxacin对OB的作用较弱，作者将研究目标转向PCa细胞。抗体微阵列已经证明PCa细胞通过释放多种细胞因子，包括骨形态发生蛋白（BMPs）、成纤维细胞生长因子（FGFs）、胰岛素样生长因子（IGFs）、生长分化因子（GDFs）和TGF-β诱导异位骨形成。在作者的研究中，作者检测了C4-2B细胞与MC3T3-E1共培养过程中BMP、FGF、IGF和TGF家族基因的表达，并发现TGF-β1在共培养48小时后升高了数十倍（图5E）。然后，作者使用qPCR、WB和ELISA检测Procoxacin是否能抑制共培养的C4-2B细胞中TGF-β1的表达和分泌，结果显示Procoxacin显著降低了TGF-β1的表达和分泌（图5F、G和H）。在经过Procoxacin处理的胫骨中，IHC染色结果也显示癌细胞中的TGF-β1显著减少（图5I）。由于C4-2B细胞产生的TGF-β1数量比OBs产生的TGF-β2高数百倍，正如ELISA检测结果所示，作者推测TGF-β1是Procoxacin抑制C4-2B诱导的MC3T3活化的关键效应靶向物。因此，作者将Procoxacin与10 ng/ml的TGF-β1一起添加到共培养体系中，发现TGF-β1的补充恢复了MC3T3-E1细胞的钙沉积能力（图5J）。与此一致，TGF-β1（10 ng/ml，24 h）的补充在Procoxacin存在的情况下恢复了共培养的MC3T3-ORE细胞中荧光酶报告基因的表达（图5K）。综上所述，这些结果表明Procoxacin可能通过靶向PCa来源的TGF-β1在骨微环境中抑制OB的活化。

1.6 Procoxacin 的一个药物靶点是 14–3‑3ζ

Procoxacin 在潜在药物靶点的硅筛选中的结果，尽管作者已经发现 Procoxacin 的作用靶点是 TGF-β1，但Procoxacin如何调节PCa-OB微环境中TGF-β1的表达仍不清楚。 迄今为止，尚未确定 Procoxacin 的分子靶点。 为了揭示潜在的药物靶点，作者将Procoxacin与蛋白质数据库（PDB）中的晶体配体进行查询。通过使用Morgan指纹的Dice相似性阈值为0.35和拓扑药效团指纹的相似性阈值为0.8，得到了五个不同的配体及其关联蛋白质，包括RAF/14-3-3ζ蛋白复合物、FKBP/mTOR复合物、蛋白磷酸酶PP1、核受体RORγ和肌动蛋白。为了确定原子级别的可能蛋白质靶点，作者对这五个蛋白质进行了分子对接。结果显示，Procoxacin 对肌动蛋白、核受体 RORγ 和蛋白磷酸酶的结合亲和力较弱。值得注意的是，许多天然化合物调节磷酸酶的活性。相比之下，Procoxacin 预测与RAF/14-3-3ζ复合物和FKBP/mTOR复合物结合，并显示出较高的结合亲和力（ΔG值分别为-9.4 kcal/mol 和 -9.1 kcal/mol）。

预测显示，Pro 的羧基与 RAF/14–3-3ζ 接口处的钾离子相互作用，并与 14–3-3ζ 的 Lys120 形成盐桥和 Ser45 形成氢键。相邻的乙基部分插入到 14–3-3ζ 的 Lys120 和 Phe117 之间的疏水裂隙中（图6A）。为了确认 Pro 与 14–3-3ζ 的结合，作者在 C4-2B 细胞中进行了磁珠捕获实验。如图6B所示，在 Pro 结合的磁珠（P Beads）组中观察到了一个较弱的14–3-3ζ条带，而在空白磁珠（E Bead，阴性对照）组中没有观察到条带。此外，表面等离子共振（SPR）实验提供了 Pro 结合到 14–3-3ζ 的直接证据（图6C），其解离常数（KD）为1.93 μM（图6D）。另外，预测显示 Pro 结合到 FKBP/mTOR 复合物（图S6）。简而言之，Pro 的羧基端通过插入到主要由芳香侧链勾勒出的疏水腔中与 FKBP5 结合。螺旋环将 mTOR 的 FRB 域牢固地固定在 FKBP5 的表面上。接下来，作者通过使用 shRNA 技术对 14–3-3ζ 进行沉默，测试了 14–3-3ζ 是否能调节 Pro 的药效。图6E显示了三种具有最佳沉默效果的 sh140。使用 sh140 对 14–3-3ζ 进行沉默后，在 C4-2B 细胞中，Pro 的IC50值增加，表明 14–3-3ζ 的沉默导致 Pro 的细胞毒性降低（图6F）。类似地，在与 C4-2B-sh140 细胞共培养的 MC3T3-ORE 中，Pro 对 Luc 的影响并未显著下调（图6G）。此外，在小鼠的胫骨中，14–3-3ζ 沉默后，PCa 细胞的生长放缓，Pro 的治疗效果也减弱（图6H）。

1.7 通过Procoxacin/14–3‑3ζ结合，阻断了TGF-β1/C-Raf/MAPK反馈环路

14–3-3ζ是14–3-3适配蛋白家族的七个成员之一，通过介导蛋白质间的相互作用调节多种细胞功能。作者通过共免疫沉淀实验检测了C4-2B细胞裂解液中14–3-3ζ与C-Raf的相互作用，并发现在Pro处理的样品中，与C-Raf结合的14–3-3ζ明显增多，而在DMSO处理的样品中减少（图7A）。此外，免疫荧光(IF)图像显示，在Pro处理后，14–3-3ζ与C-Raf在C4-2B细胞中具有共定位（图7B）。这些结果表明，Pro的插入促进了Pro与Raf/14–3-3ζ复合物结合14–3-3ζ与C-Raf的结合。以往的研究已经报道了14–3-3ζ与C-RAF的Ser233和Ser259磷酸化依赖性结合抑制了Ras介导的C-Raf/ERK MAPK通路的激活，而14–3-3ζ与Ser621的结合则起到激活作用。在直接培养条件下，Pro显著增加了C4-2B细胞中C-Raf Ser259的磷酸化水平，但不影响Ser621的磷酸化水平，并下调了磷酸化的MEK1/2和ERK1/2，表明Pro对C-Raf/ERK MAPK通路具有抑制作用（图7C）。当与MC3T3-E1共培养时，C4-2B细胞中C-Raf的pS259/pS621比值降低，ERK MAPK通路被激活。通过TGF-β类型I受体（TβRI）抑制剂SB-431542阻断TGF-β信号转导，可逆转pS259/pS621比值的下降，从而使C-Raf/ERK MAPK通路失活。这一结果表明，OB诱导的C-Raf/ERK MAPK通路激活是依赖于TGF-β的。相比之下，Pro不能逆转共培养C4-2B细胞中的pS259/pS621比值，但仍然使下游的ERK MAPK通路失活（图7D）。另一方面，作者测试了TGF-β1过度表达是否是C-Raf/ERK MAPK通路过度激活的结果。在蛋白水平上，通过PD98059抑制MEK1/2和ERK1/2有效地抑制了共培养C4-2B细胞中TGF-β1的上调，与Pro的效果相似（图7E）。在mRNA水平上，作者发现在细胞培养中添加外源TGF-β1可以诱导TGF-β1自身的转录，并且这可以被Pro在直接培养或共培养条件下抑制（图7F）。这些结果表明，在PCa-OB微环境中存在TGF-β正反馈调节环路。接下来，作者确认了14–3-3ζ在调节TGF-β/C-Raf/MAPK正反馈环路中的作用。14–3-3ζ的沉默抵消了Pro对C-Raf/ERK MAPK通路的抑制作用，尤其是在共培养条件下（图7G）。此外，在14–3-3ζ沉默后，PD98059仍然可以抑制OB诱导的C4-2B细胞中TGF-β1的转录，而Pro的效果则减弱（图7H）。一致地，对连续骨切片进行的免疫组化染色显示，在14–3-3ζ沉默后，由骨转移的PCa细胞产生的TGF-β1受Pro的抑制效果不再显著（图7I）。所有这些结果表明，Pro通过促进14–3-3ζ与C-Raf抑制性磷酸化位点的结合，阻断了PCa-OB微环境中TGF-β1的正反馈环路（图7J）。

1.8 Procoxacin能够预防骨生成型和骨吸收型前列腺癌的转移。

使用小鼠心脏内注射模型，作者研究了Pro对前列腺癌转移的影响。如图8A和B所示，Pro显著减少了骨生成型C4-2B细胞和骨吸收型PC-3细胞形成的转移灶数量。生存分析（图8C和D）显示，Pro显著延长了接受心脏内癌细胞注射的NOD-SCID小鼠的生存时间。

讨论

本研究证明了基于肿瘤宿主相互作用的药物筛选策略的可靠性和可行性，并显示Pro可能是治疗骨转移前列腺癌的潜在治疗药物，通过阻断骨转移中的TGF-β反馈环路。Procoxacin 的一个药物靶点是 14–3‑3ζ。为了确认 Pro 与 14–3-3ζ 的结合，作者在 C4-2B 细胞中进行了磁珠捕获实验。在 Pro 结合的磁珠（P Beads）组中观察到了一个较弱的14–3-3ζ条带，而在空白磁珠（E Bead，阴性对照）组中没有观察到条带。此研究应用了小分子靶点发掘技术，对Pro的药效机制研究具有重要的意义。

反应步骤：Magnetic microbeads were purchased from Shanghai Yike Biological co., Ltd. To synthesize Procoxacin-conjugated magnetic microbeads, 10 mg amino microbeads, 13.5 mg 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDCl, 0.070 mmol), and 8.6 mg 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 0.070 mmol) were added into the solution of 54.1 mg Pro (0.07 mmol) in 20 ml CH2Cl2. The solution was stirred at room temperature under nitrogen for 24 h and then concentrated under reduced pressure. Microbeads were collected with a magnet, then blocked in 2.5 mg/ml of BSA for 1 h at room temperature and washed with PBS for 3 times to yield the conjugated magnetic beads.