邻近编码技术解析结直肠癌患者 血浆样本的单外泌体亚群构成

Author：山东大学基础医学院李景新教授团队

Journal:Research（IF11）

PublicationTime：2023.01.30

DOI：10.34133/research.0041

研究背景

        结直肠癌是一种常见病不仅有有较高的发病率，也有较高的转移率，在转移后显著的降低了生存率，然而，先进的结直肠癌筛查、诊断和治疗方法仍在研究中。

        外泌体是一种膜包被的细胞外囊泡（EV），其直径范围为30至150nm。细胞释放外泌体来传递细胞间的生物信息。据报道，外泌体在调节肿瘤增殖、转移、化疗耐药性和复发中发挥重要作用，因此是液体活检的潜在靶标。

        由于细胞来源和微环境的不同刺激，外泌体在分子组成上高度异质。外泌体的膜蛋白反映供体细胞类型，促进外泌体囊泡的特异性靶向，以在其受体细胞上发挥生理学或病理学作用。当为了液体活检或治疗应用的目的而进行体液的外泌体分析时，外泌体的异质性尤其关键。由于在酶联免疫吸附试验或质谱等整体水平分析中缺少异质性，因此单独研究外泌体是有意义的。

        邻近编码分析技术（PBA）是一种用于单外泌体分析方法，可以同时分析单个外泌体上的几百种表面蛋白。PBA使我们能够通过高度异质性的表面蛋白组成来区分外泌体，并鉴定样本中的外泌体亚群。PBA检测将是液体活检的有前途的工具。

研究方法

PBA检测流程

实验方法

•邻近编码技术（PBA)：用于检测EV表面蛋白，本研究同时检测115种蛋白，并在单囊泡水平上进行定量分析•RNA提取&RT-PCR•Westernblot•集落形成和Transwell实验

数据分析方法

•统计分析：配对t检验•FlowSOM聚类分析、t-SNE可视化

研究结果

差异表达分析表明：外泌体的蛋白组特征在CRC进展过程中发生了改变，有望成为潜在的癌症诊断标志物，值得进一步研究。

lEV计数：1.06× 105/sample、蛋白质的中值数量为2.42× 105、平均检测到2.4种蛋白质/EVlHC组与CRC组之间无显著差异l与HC组相比，CRC患者血浆样本EV蛋白表达增加的有EPS8、ITGB3、ITGA 6、ADAM 10、ILK、CD 9、CD 151和RIOX2l表达降低：ITGAM、NT5E、CCR 2、THY 1、ITGAL、TIMP1和MMP 2

ROC分析表明这些差异表达蛋白具有良好的癌症诊断效能或转移预测效能

癌症诊断效能的ROC评估：

转移预测效能的ROC评估：

lFlowSOM算法（一种无监督的机器学习过程）将CRC患者和健康供体的血浆样品外泌体识别出了12个亚群。lEV亚群4占总EV的比例最大（32.85%），并随着CRC分期的升高呈增加趋势。特征蛋白：ITGA6和ITGB 3lEV亚群11在CRC患者的血浆样品中显著降低。特征蛋白：ITGAM、ITGAL

lITGB3+亚群显著上调lITGAM+亚群显著下调

体外实验验证HC和CRC来源外泌体的功能

HC血浆外泌体抑制CRC细胞系的增殖，mCRC患者的血浆外泌体促进CRC细胞系的增殖

超离心提取

EV表征：WB、TEM、NTA

l血浆外泌体具有约90 nm的平均直径l外泌体生物标志物CD 81和TSG 101鉴定外泌体l图C：ITGAM在HC中表达最高，其次是结肠腺瘤，并且在原发性CRC和具有肝转移的CRC中表达最低；与PBA分析结果一致。

再次证明ITGAM阳性外来体可以用作CRC早期诊断的生物标志物

HC血浆外泌体处理HCT116和SW 480，抑制了细胞增殖、迁移和侵袭；

l来自肝转移性CRC患者的血浆外泌体中ITGA6和ITGB 3高表达，与先前PBA分析一致l肝转移CRC血浆外泌体显著促进CRC细胞系的迁移和侵袭

小鼠模型体内实验验证

来自HC血浆外泌体抑制皮下CRC肿瘤的生长，而肝转移性CRC血浆外泌体促进体内CRC细胞的转移

l与对照组相比，用健康供体外泌体注射的治疗组中肿瘤生长减少，由肿瘤重量减少43.4%

l接受mEV注射的小鼠的肺转移灶平均数量约为32.9个，而注射PBS的对照组平均有7.6个转移灶l组织学分析再次验证了来自肝转移性CRC血浆EV的转移促进作用

体外实验验证ITGB3-rich EV功能

l富含ITGB 3的外泌体能够显著促进细胞迁移和侵袭能力

体外实验验证ITGAM-rich EV功能

来源于PBA\THP-1的富含ITGAM的EV显著抑制HCT 116和SW 480细胞系的细胞增殖、迁移和侵袭

体外实验验证M1、M2巨噬细胞的EV对癌症的抑制作用

lM1和M2来源的外泌体均抑制HCT116细胞系的迁移l   证明了由M1样而非M2样巨噬细胞分泌的外泌体显著抑制了SW 480中的迁移及侵袭和HCT116的侵袭

结果表明M1巨噬细胞来源的富含ITGAM的外泌体在CRC细胞系的侵袭和迁移中起抑制作用

体内实验验证ITGAM、ITGB3EV对CRC肿瘤的影响

l与对照组相比，在注射PMA/THP-1外泌体的治疗组中观察到肿瘤生长减少，肿瘤重量减少57.4%l用SW 480-ITGB 3LV细胞来源的外泌体处理的小鼠中，肺转移灶的平均数量约为66.7，

而用SW 480-CON LV细胞来源的外泌体注射的对照组平均具有19.2个转移灶

外部独立队列验证潜在生物标志物的诊断效能

l差异表达分析表明：ITGA 6、ITGB3、CD9、CD 151和ADAM 10表达上调，CCR 2、ITGAM表达下调，与发现队列结果一致。lROC分析表明选择ITGA6、ITGB 3、CD 151和ADAM 10作为生物标志物的诊断效能（AUC）分别为：0.834、0.856、0.8、0.812

外部队列验证潜在生物标志物在CRC早筛中的潜力

lTMM归一化和方差分析之后识别出了26个高表达蛋白和23个低表达蛋白（热点图）lTMM归一化和方差分析之后识别出了26个高表达蛋白和23个低表达蛋白（热点图）

ROC分析表明ITGB3+亚群的早癌筛查效能为0.835

研究结论

本研究通过邻近编码分析技术（Proximitybarcodingassay，PBA）和无监督机器学习FlowSOM算法发现了2个差异显著的外泌体亚群：ITGB3阳性和ITGAM阳性外泌体亚群。体外和体内实验证明，ITGB3+外泌体促进CRC的增殖、迁移和侵袭；而ITGAM+外泌体抑制CRC发展。本研究还提供了ITGAM+外泌体的来源之一是巨噬细胞的证据。ITGB3+外泌体和ITGAM+外泌体是早期CRC管理的有前景的诊断和治疗靶点。此外，本研究也表明了PBA检测技术有望成为各种癌症液体活检有效工具。