SMI技术揭示滑膜树突状细胞在类风湿性关节炎中的双重角色

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎症性关节疾病，其特点是免疫耐受的破坏。靶向疗法的进步改善了类风湿关节炎的治疗。然而，仍有40%的RA患者无法实现疾病的持久缓解或恢复免疫耐受状态。

以往研究表明，树突状细胞(DCs)在调节适应性免疫反应和恢复免疫耐受方面具有重要作用。例如，在癌症研究中发现富含免疫调节分子的mReg DC (CCR7+ LAMP3+)与诱导免疫原性、免疫调节和迁移的基因程序有关，但其功能取决于所处的组织微环境。在RA研究中，也有间接证据支持滑膜DCs (ST-DCs)在RA发病机制中发挥重要作用。然而，目前仍然缺乏ST-DCs功能多样性的综合图谱，DC调节人体免疫的分子机制也尚不清楚。

在该研究中，研究人员针对ST活检组织，采用单细胞RNA测序(scRNA-Seq)、CosMx单细胞空间转录组和ST-DC/T细胞共培养技术，鉴定出不同的DC亚群；发现了它们从外周血(PB)向滑膜组织(ST)的迁移机制；描绘了人体ST-DCs的空间分布特征，以及它们在免疫耐受中的功能多样性和空间特异性，进而揭示了RA的病理机制。

研究方法：

• 单细胞RNA测序(scRNA-seq)：用于分析滑膜组织和外周血中髓系DCs的转录组特征；

• CosMx单细胞空间转录组学：用于在组织原位分析不同DC亚群的空间分布及其与T细胞的相互作用；

• DC与T细胞共培养系统：用于研究DCs对T细胞激活的影响。

主要发现:

• 具有耐受表型的AXL+ DC2亚群主要位于健康的滑膜下面；

• 炎性iDC3亚群主要填充在RA组织的增生内膜，它们能激活CCL5+效应记忆型T细胞(Tem)和/或外周辅助性T细胞(Tph)，促进滑膜炎的发生；

• CCR7+ DC2亚群主要占据RA组织的下层淋巴区域，它们与初始T细胞相互作用可能推动新效应T细胞的局部扩增；

• 在RA缓解期，这些致病性的空间细胞社群得到了一定程度的减弱，但耐受性DC2仍未恢复。

• 在复发前，血液中ST-DC3亚群前体被激活，可作为预测RA在缓解期复发的特征。

综上发现，针对致病性DC3或恢复耐受性DC2对恢复RA关节的免疫平衡起到至关重要的作用。

不同髓系DC亚群定位于不同的ST空间域

(A) 从CosMx单细胞空间转录组数据(960-plex gene)中识别出主要的细胞类型。这些细胞来自69个FOV中的127,199个细胞；(B) 活跃期和缓解期RA滑膜代表性FOV中的单细胞分割和细胞类型注释；(C)不同空间域的聚类UMAP图。不同空间域根据主要细胞类型组成和差异基因表达进行注释；(D) 活跃期和缓解期RA滑膜组织代表性FOV的空间域注释示意图；

(G）ST髓系DC亚群在活跃期RA滑膜组织不同空间域中的分布。

(H）热图总结了空间域中每个髓系DC亚群的比例。

不同的髓系DC亚群定位于不同的ST空间域

为了在组织真实结构背景下阐明不同髓系DC亚群的功能，研究人员利用CosMx单细胞空间转录组技术，针对未接受治疗、疾病活跃期和疾病缓解期RA患者的ST活检组织绘制了不同DC亚群的空间图谱，并评估了它们与T细胞亚群的相互作用。为了准确识别组织内的细胞，研究人员采用了Mesmer和Baysor方法，分别根据核染色和转录本密度来界定细胞边缘。

首先，研究人员根据不同细胞类型的组成、分布和转录特征，确定了8个不同的ST空间域(niches)。接下来，研究人员描绘了这些空间域中不同DC亚群的空间分布。分析发现，在活跃期RA样本中，DC亚群在富含髓系细胞的内膜、TGF-b+髓系下膜、髓系/FLS下膜和淋巴空间域中格外富集，并且不同DC亚群显示出特异性的空间分布：CCR7+ DC2 (mReg/MIR155+)明显富集于淋巴空间域；其余的DC2 (CCR7-)则在TGF-b+髓系空间域富集；DC3及iDC3在富含骨髓的内膜空间域中明显富集。

总之，ST-DC亚群呈现出组织空间分布的特异性，表明它们在调节适应性免疫方面具有不同的局部功能。

ST-DC亚群与滑膜中的T细胞表现出不同的相互作用模式

RA滑膜中DC和T细胞亚群的整合分析

为了推断DC亚群在活跃期RA组织中的功能，研究人员接下来鉴定了滑膜组织中的CD4+ T细胞亚群，并基于CosMx单细胞空间转录组数据进行邻域分析，确定了不同细胞亚群在组织中的相互作用，进而推断出不同ST-DC亚群对T细胞的刺激功能。

对滑膜中DC/T细胞相互作用的总体评估显示，与缓解期RA相比，活跃期RA中ST-DC与CD4+ T细胞之间的直接相互作用更多。研究人员进一步发现，在活跃性RA中，不同ST-DC亚群与T细胞亚群的相互作用模式也各不相同，这意味不同ST-DC对T细胞的刺激功能也有所差异。总体而言，CCR7+ DC2s (包括mReg及其中间阶段MIR155+细胞)和iDC3s与T细胞的相互作用具有最显著的统计学意义，表明它们具有最强的T细胞刺激功能。此外，它们与产生BAFF的T细胞(TNFSF13B+)和CXCL13+CCL5- Tph细胞的相互作用也非常强，这表明它们在滑膜的异位生殖中心反应中发挥作用。

此外，CCR7+ DC与淋巴空间域中的初始T细胞相互作用更强。虽然这些T细胞只占滑膜中T细胞总数的不到5%，但它们却完全位于这个特定的空间域中。富含髓系细胞的增生层空间域是活跃期RA滑膜的一个独特特征，也是DC3及iDC3亚群的主要生存环境。虽然与淋巴空间域相比，富含髓系细胞的空间域的T细胞含量较少，但该空间域T细胞包括高度活化的CCL5+ Tph和CCL5+ Tem的Th1 细胞。

对所有空间域的邻域分析表明，与其他DC亚群相比，iDC3更倾向于直接与CCL5+ Tem细胞相互作用，这种相互作用扩展到了CCL5+ Tph细胞。其他DC3亚群主要与Tcm细胞相互作用，这表明这些DC3细胞亚群可维持ST中这些细胞的储备，而iDC3细胞亚群则可能在激活致病性CCL5+ Tem和 CCL5+ Tph细胞群中发挥重要作用。为了检验ST-iDC3是否会驱动活跃期RA滑膜中CCL5+ T细胞的活化，研究人员建立了滑膜活检组织分选的DC细胞与自体记忆性PB CD4+ T细胞的微量共培养系统加以验证。

滑膜组织iDC3支持CCL5+ Tem/CCL5+ Tph细胞的活化

总而言之，CosMx单细胞空间转录组学数据和细胞共培养结果共同证实，与ST-DC2s相比，ST-iDC3s能更有效地激活记忆性CCL5+ Tem细胞和CCL5+ Tph细胞。