Nature Biotechnology “老”朋友的“新”技术重磅发文：CosMx™ SMI单细胞空间原位成像技术

空间多组学技术研究如火如荼，研究工具不断推陈出新。一直以来，以亚细胞分辨率解析组织中RNA和蛋白质的空间分布是空间生物学领域的一个挑战。在2022年AGBT大会上，NanoString发布了最新的单细胞/亚细胞空间多组学创新平台 — CosMx™ Spatial Molecular Imager（SMI）空间原位分子成像系统。

CosMx™ SMI是一个完全自动化的集成平台， 能够支持研究者针对多种样本类型，包括福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE），在单细胞甚至是亚细胞分辨率对超多靶标（980个RNA和108个蛋白质）在空间原位的表达信息进行了高灵敏度和高特异性的检测分析。

CosMx™ SMI是基于原位杂交循环成像技术，通过原位杂交（ISH）探针和称为“报告器”的荧光读取探针（图1a）实现在单细胞水平原位检测组织切片中的RNA和蛋白质。CosMx™ SMI化学原理是一种无酶介导、无核酸扩增、基于杂交的单分子条形码检测方法，可直接应用于标准玻片上的FFPE和新鲜冷冻组织。

ISH探针由长度为35–50 nt的DNA序列组成，该DNA序列（结合域）将与组织中的RNA靶标特异性杂交，该捕获序列末端是长度为60–80 nt的DNA“读出域”用于对该靶标RNA进行表达量鉴定。读出域由四个连续的10–20 ntDNA序列组成，允许含有荧光标记的成像条形码（报告器）按照一定次序结合。此外，针对每个靶标基因，设计有五个ISH探针，每个ISH探针的结合域具有独特的捕获序列，但具有相同的读出域序列。区域结合，并同步检测该靶标RNA的表达。该设计使CosMx™ SMI对于FFPE组织具有超高的检测灵敏度，即使只有一种ISH探针的结合域成功地与该RNA靶标结合，也不影响在读出步骤对成像信号的捕获和对RNA靶标表达信息的有效检测。每个报告器所包含的荧光染料的数量都经过严格、精准的设计和控制，针对低、中、高表达的基因分别设计15–60个荧光染料数量。这些染料与具有光可裂解（PC）连接体的荧光团共轭的核酸序列组装在一起（图1a），可以在每次杂交成像完成后，通过UV照射和洗涤步骤有效地淬灭荧光信号（图1b）。针对每个靶标RNA，都预先设计有特异性的64位成像条形码，通过对报告器的循环杂交成像，得到64位条形码的荧光信息，进而提供足够的荧光信噪比来实现在空间原位对单个RNA或蛋白质分子定量。

CosMx™ SMI报告器设计原理的主要优点是在不同的组织背景中保证高信噪比（SNR）的检测，即使是对于FFPE组织样本中存在严重自发荧光的情况下，也能够实现对单个RNA或蛋白质分子在空间原位的有效、准确定量。

在单细胞空间多组学分析中，精准识别、区分每个单细胞是关键的核心技术，也是评估不同技术平台的重要考量指标。将靶标RNA精准地对应到单个细胞，特别是在细胞大小、密度、状态非常复杂的真实组织样本中，而且还要在单张玻片上实现对RNA和蛋白质的共检测能力，这对细胞边界界定或细胞分割的化学原理和算法都提出了极高的要求。在众多细胞分割方法中，依靠细胞核染色来预测细胞边界的技术方法会受到低密度和高密度细胞环境的显著挑战。而CosMx™ SMI则使用了细胞核染色联合混合抗体的通用染色结果，并结合深度的AI机器学习算法，综合评判和精准勾勒细胞边界来完成细胞分割。精准的细胞分割是下游数据分析（包括细胞分型、细胞状态分析和细胞间互作等）的基础，是获得高质量单细胞空间多组学数据的重中之重。

CosMx™ SMI平台的另一个独特特点是针对FFPE样品具有优秀的检测能力和数据表现，并使用标准的、自动化的FFPE样品制备方法。CosMx™ SMI采用与标准原位杂交几乎相同的样品制备工作流程，不需要组织清除和扩增。CosMx™ SMI的样品准备时间1天左右，手动操作时间小于60分钟，也可以选择使用标准组织样本制备平台（如Leica Bond）实现自动化。CosMx™ SMI简单的样本制备流程和自动化方案可大幅节省时间和劳力，并保证了组织制备的高度一致性和结果的可重复性（图5）。

CosMx™ SMI 数据与RNA-seq和RNAScope数据比较

CosMx™ SMI 在不同NSCLC肿瘤FFPE切片中检测结果的可重复性

CosMx™ SMI 原位杂交循环成像的化学原理以及系统硬件和分析算法软件的联合使用实现了在单细胞内进行超多靶标的高灵敏度分析。在检测过程中，SMI也会在组织Z轴进行图像获取，结合X,Y轴图像中荧光信号数据实现三维（3D）空间重构，联合细胞分割算法得到的单细胞边界，可以将每个靶标RNA分配给单个细胞，并映射到所在单细胞中的亚细胞空间区域，例如细胞核、细胞质、细胞膜（图1c）。为了证明SMI可实现在亚细胞分辨率的RNA检测，研发人员设计了一套SMI探针，同时针对线粒体和核基因。在U2OS细胞中用荧光探针连接的抗体标记线粒体和细胞膜（CD298），用DAPI标记细胞核（图1d）。SMI RNA数据分析显示，98.7%由SMI检测到的线粒体基因与基于抗体的线粒体标记特异性共定位，96.9%核基因严格位于细胞核内。这些结果表明，SMI可以实现在亚细胞分辨率下对RNA进行精准定位和检测。

类似于针对RNA的检测，SMI也可以通过将读出域序列与捕获靶标蛋白的抗体进行链接，进而实现对蛋白质的空间原位检测。最终得到的输出文件是解码后的OME-TIFF文件，显示出每个靶标蛋白质的空间单细胞定位模式和表达强度。

传统成像技术方法对现实世界的FFPE样本进行超多靶标的多组学检测面临很大挑战。在本研究中，利用CosMx™ SMI技术检测出样本中的800,327个细胞，其中>96%的细胞通过了质量控制，并对980重的RNA进行亚细胞空间分辨率下的表达分析。特别值得注意的是，SMI对于FFPE样本中核酸的完整性具有极强的耐受度，5号和13号肺癌FFPE样本的DV200值<30%，甚至无法满足Bulk RNA测序；9号和12号肺癌FFPE样本表现出中等RNA质量。SMI在如此宽泛的DV200（或RIN值）范围内依然达到了>96%的细胞检测效率，这一结果反映了SMI 35-50nt的杂交捕获区可以对RNA严重降解的FFPE样本进行有效检测和定量，并保证特异性和敏感性。SMI蛋白检测panel中超过80%的抗体是直接从GeoMx DSP平台上开发并广泛验证过的抗体库中挑选出来的，并经过病理学专家的评估和审查。SMI目前可实现对多达980个RNA和多达108个蛋白质的单细胞空间原位检测，这是迄今为止在FFPE组织上以单细胞和亚细胞分辨率进行的最高靶标数目的空间RNA和蛋白质分析。基于SMI 精细的荧光条形码编码原理和方案，在SMI平台上对RNA和蛋白质检测通量的拓展还有非常大的潜力。

总之，在这项工作中，NanoString的研究团队展示了CosMx™ SMI单细胞空间原位分子成像系统在真实世界非小细胞肺癌和乳腺癌的FFPE样本中以亚细胞分辨率对980个RNA和108个蛋白质的超多重靶标原位分析能力，不仅可以实现细胞精细分型、不同细胞在组织中的空间定位，还可以直接检测细胞交界处配受体的表达，进而为深入揭示细胞异质性、组织微环境、细胞状态、细胞功能和细胞间通讯机制带来全新见解。