多组学跨界深入探讨

“无所不为，无处不在”的微生物，与人类的健康息息相关。人体微生物组更是享有“人体第二基因组”的盛名。人体的不同部位，微生物的群落结构也是千差万别。

2017年10月发表在《Science》上的一篇论文，为我们提供了很好的参考。今天就来解析一下这篇文章，看看大牛的实验设计和多组学技术的整合分析是如何开展的。

研究重点关注了口腔来源的细菌定植于肠道造成的不良健康结果，诸如炎症性肠病等。然而，口腔菌是如何异位定植于肠道的，这中间的因果关系仍知之甚少。利用无菌动物技术，动用了包含微生物组多样性测序，单菌基因组测序，转录组测序及多种理化及形态学研究手段，全面阐释了菌群异位定植造成不良影响的机制。研究发现从肠道菌群中分离出来的Klebsiella spp. 定植于肠道后，可以显著的诱发TH1细胞。Klebsiella spp.菌株耐多种抗生素，导致其可以再肠道菌群发生紊乱时定植，并在宿主具有遗传易感性的条件下造成严重的肠道炎症反应。

首先，我们来看看本研究的思路设计：

研究用两名克罗恩症（CD）患者的唾液（CD#1, CD#2），进行无菌小鼠（GF）灌喂，小鼠种系为C57BL/6, BALB/c,及 IQI小鼠。灌喂后隔离培养6周。

• CD患者唾液及灌喂小鼠粪便进行16s rRNA测序，采用平台为Roche 454平台，V1-V2区16s rRNA测序。

• 唾液灌喂培养的小鼠小肠及结肠粘膜固有层（LP）进行免疫细胞检测。

• 利用GF+CD#2分离培养诱导Th1细胞的细菌，获得224个克隆，基于16s测序进行菌种鉴定。分离培养后再进行GF小鼠灌喂研究。

• 接种确定的Th1诱导菌株后，对小肠细胞的转录组变化开展研究，确定与该反应相关的基因及发挥的作用。

• 重复健康人及溃疡性结肠炎（UC）病人唾液微生物及灌喂无菌小鼠实验，验证口腔微生物定植于肠道炎症性反应之间的关系，探讨相关作用机制。

1.基于16s rRNA测序的结果，研究者发现相比较于酒精中毒或健康人群样本，患有溃疡性结肠炎（UC）、玛丽硬化性胆管炎（PSC）、胃食管反流症（GERD）的患者，其粪便中常见口腔耐氧菌的丰度显著性增高（Fig.1A）;于是，研究者提出了这样的假设，即“口腔中的一部分微生物会在特定环境下定植于肠道，导致肠道免疫系统异常激活，进而造成慢性炎症性反应。”基于此，研究者设计了上述实验。

2.研究发现，两名CD患者的唾液微生物构成一致性较高，但是灌喂小鼠的粪便微生物存在显著性差异（Fig.1C）。免疫细胞检测发现，CD#1患者唾液灌喂的小鼠，肠道T细胞未发生显著性变化，但是CD#2患者唾液灌喂的小鼠肠道中，发生了显著性的IFN-γ+ CD4+ T cell（TH1）增高（Fig.1B）。针对粪菌微生物构成的分析发现，粪菌中大部分菌种实际是口腔微生物的次要成分，这说明口腔微生物确实会在一定条件下发生肠道内的定殖，并且其中的一部分可能造成肠道Th1细胞的积累。通过分离鉴定，定殖在肠道的口腔微生物菌种主要是Gemella,Bifidobacterium,Streptococcus,Escherichia,Fusobacterium, Veillonella, Anaerococcus 和Klebsiella。为了检测这些菌种诱导Th1细胞的能力，实验分别培养这八种菌并混合灌喂给GF小鼠。结果发现Kp-2H7菌株是诱导Th1细胞的主要菌种（Fig.1D）。抗生素实验研究显示，Kp-2H7菌株具有多种抗生素耐药性，但不同抗生素对该菌株在肠道内的定殖影响不一，而Th1细胞的增加与Kp-2H7在肠道内的定殖相关（Fig.1E-F）。组织学分析显示（含扫描电镜观察），Kp-2H7菌株相较于其他菌种或菌种组合，能造成更为严重的炎症反应（Fig.1G-I）。

3.为了探讨Kp-2H7菌株诱导Th1细胞的机制，研究用热灭活的Kp-2H7灌喂GF小鼠（WT B6 mice）三周，发现热灭活菌株对诱导Th1无效(Fig.2A)。荧光原位杂交显示，Kp-2H7主要在黏液层，暂无其附着在小肠上皮层的证据（Fig.2B）。处于系统发育不同位置上的K. pneumoniae菌，其诱导Th1细胞的能力也有较大区别，可以看出接种于B6 WT小鼠中菌株的诱导能力（Fig.2C），接着研究对不同菌株开展全基因组分析，研究发现有61个同源基因与Th1细胞诱导能力成正相关（Fig.2D）研究还发现，在缺乏ATF-like3(Batf3-/-)的小鼠中，Kp-2H7诱导Th1能力是发挥不出来的（Fig.2E），在不同因子缺失的小鼠中，Kp-2H7诱导Th1的效果也会不同（Fig.2F&Fig.2G）。研究中对接种Kp-2H7和BAA2552一周的ECs和DCs也做了转录组测序，研究其基因表达的情况（Fig.2H），发现在Kp-2H7接入的野生型无菌小鼠中IFI诱导基因，组织相容性抗原复合体等相关基因的表达均上调，而在IFI受体缺陷型小鼠（IFNgR1–/–）中接种Kp-2H7则不会有相应的反应（Fig.2I）。

4.为进一步证明口腔微生物与Th1诱导之间的关系，研究追加了健康人的唾液微生物研究，UC病人及口腔唾液灌喂野生型B6小鼠的研究结果显示，2号UC患者唾液微生物灌喂会引发Th1诱导（Fig.3A），从其盲肠培养物中分离得到了13个菌株（Fig.3B）。再用这13个菌株的混合物进行灌喂实验，可以很好的复制无菌鼠灌喂UC#2的Th1诱导效果，并且筛选出实际发挥作用和单菌株信息（Fig.3C）。这组研究中结果发现，在肠道Th1诱导中其最主要作用的口腔微生物为Ka-11E12，它同时还具有多种抗生素耐药性（Fig.3D）。这个菌株在Il0-/-小鼠中可引发各类炎症反应，其作用机制与Kp-2H7相似。同样的，FISH结果表明，该菌株也不会再ES表面产生损伤（Fig.3F）。综合上述研究结果，在肠道中诱发Th1细胞的是Klebsiella的不同株系。

5.对16s rRNA测序数据进行深度分析，结果发现，在不同人群（CD、PSC、酒精中毒）中Klebsiella菌的相对含量都显著高于健康人群（Fig.4A）。基于此，研究者拓展了该研究的范围，并在IBD患者也体内发现Klebsiella菌的相对含量有显著性的升高。在Kp-2H7介导的Th1诱导中相关的基因，在含有Klebsiella菌的IBD患者的粪便研究中也被富集到，但在不含有Klebsiella菌的IBD患者粪便中则没有响应的富集（Fig.4C & 4D）。