肠道菌群研究亮点解析

套路也一样能够做出高端大气上档次的研究来。今天就跟大家分享一篇“套路”的肠道微生物研究，只有三个简单的分组设计，照样做出了影响因子7分以上的好文章。这就是今年8月发表在AP&T上的HCV肝硬化患者的肠道微生物组研究——丙肝药物对肝硬化患者肠道微生物群落的影响。

研究共设置了3个组（健康对照control，疾病组pre-DAA，疾病给药组post-DAA），除了一些生理指标测量，文章的核心内容，只有这三组粪便样本的16s测序的内容。想想看，是不是你的方案设计可能比他的还复杂些呢？

能够赢在套路设计上，这篇研究的亮点也确实值得一提。

首先是样本的选择：这里有两个问题1，选择多少样本；2，选择什么样的样本。

这个研究中，治疗前后只有12个病人的样本，可谓小样本量研究的典型。可样本量虽小，对样本的要求和样本量的论证却是绝对的高标准严要求：

研究者首先确立了一个最小样本量要求的假设：假设接受DAA治疗后，80%病人肠道菌群中，潜在致病菌的丰度降低；而5%的病人可能观察到增高的现象——基于此，最少需要11对HCV患者（治疗前后）的样本。

之后，研究者们设置了一系列严苛的样本筛选条件，经过组织学，放射科，临床等一系列检验证实为肝硬化的患者，有过量饮酒史的不要，非酒精性脂肪肝的不要，HBV感染的不要，HIV感染的更不会要……糖尿病，肥胖症，其他肠道疾病或肿瘤的统统不要……

好吧，看得出来这真的是一个很“傲娇”的研究项目呢。

最后，还要选择出合适的control —— 研究者在患者家属中选择健康的成员，匹配了性别和年龄才用作为健康对照组——可以说这是一个很严谨的研究了，很好的屏蔽了遗传背景不同造成的影响。

患者还必须接受长期连续性的DAA治疗过程，并在完成治疗后接受全程或为期半年一次的随访——整个研究的样本筛选和采集进行了两年！

研究纳入了187例HCV感染的肝硬化患者，接受DAA治疗。最终因为各种各样的原因（包括了患者的知情后拒绝~ 这一点做的还是很值得我们称赞呐）， 175个病人未能纳入此研究中，最终只保留了12个病例样本——这样的筛选过程，可以说堪比后宫选妃的淘汰率了。

而实验本身的分组设计，就显得很简单明了了，三个组：

这样精挑细选的样本，更不能少了详实的生理生化指标的采集和分析，来瞅瞅这项研究砸下的理化指标数据：

相比之下，16s测序进行肠道菌群群落结构的研究就显得很套路了：

16s rDNA的V3-V4区扩增测序，进行菌群的群落结构分析和差异比较，寻找不同组间的差异物种，进行相关性研究：

比较DAA治疗前后及健康人群的alpha多样性指数（Chao指数），显示健康人群的多样性显著高于疾病人群，治疗后alpha多样性有改善，较治疗前有显著提升（下图A）。

PCA分析显示HCV患者接受治疗前后，肠道菌群的整体情况呈现差异性聚类模式。(下图B)

从菌群结构看，接受治疗前后，HCV的肠道微生物群落发生较大变化，DAA治疗一年后，潜在致病菌（如肠杆菌，肠球菌及葡萄球菌等）的丰度降低，可以看出HCV-Post组样本中肠道菌群组成向健康人群方向发展。但仍存在一定的小差异性(下图)。

结合理化指标状况看，DAA治疗后，炎性细胞因子和趋化因子明显降低，全身性炎症标志物水平得到改善。除1例患者外，其他全部患者的肝硬度，APR和FIB-4评分均有所改善（下图）。但肠道透过性与炎症水平未发生显著变化。

研究做到这里，少不了的要将治疗前后生理指标的变化和肠道的微生物群落，及肠道炎性症状等开展关联，寻找微生物群落与肝纤维化参数之间的相关性。结果显示，Enterobacteriaceae与CXCL10和CCL2存在较高相关性，Staphylococcus 与CXCL10 / IL1-ra / TNF-ɑ，Veillonellaceae与CXCL10 / IFN-ɡ / IL1-ra / TNF-ɑ也分别存在这种细菌与生理指标的相关关系（下图）。

总结一下，技术进步和成本的降低，让很多先进的研究技术从“王谢堂前燕”飞入“寻常百姓家”，这其实是科学研究良性发展的必然。有了更多更好的技术可以应用到我们的研究中时，并不一定需要我们有多少“不走寻常路”的科研设计。传统套路研究的深耕细作，一样可以发挥出无穷的潜力，带给我们更多的惊喜！