究竟是哪个小妖精影响肝纤维化？？

文献 | 《肝中丰富的lnc-LFAR1通过激活TGFβ和Notch途径促进肝纤维化》

基于目前还没有明确的关于lncRNA在肝纤维化中的调控机制研究的背景，作者首先通过在小鼠体内注射CCl4建立肝纤维化的稳态模型，在放大镜以及免疫荧光，免疫组织化学检测等实验方法下观察对照组和实验组差异，发现实验组纤维化区域，炎症区域，α- SMA阳性区域，Collα1阳性区域均明显高于对照组。

且实验组的α- SMA，Collα1以及羟脯氨酸水平也均显著高于对照组。通过微阵列分析实验组和对照组的lncRNA和mRNA表达情况，据lncRNA的倍数变化以及lncRNA-mRNA共表达网络筛选出10个lncRNA。

图1：诱发肝纤维化的lncRNA表达文库

通过分析在小鼠的不同组织中lncRNA的表达情况，最后筛选到lnc-LFAR1在肝中含量丰富。

将lncRNA作为后续的研究对象，首先通过对lnc-LFAR1在肝中的定位分析以及转录起始位点分析等验证了lnc-LFAR1是一个lncRNA。

之后分别在HSC细胞中以及肝纤维化的小鼠体内对lnc-LFAR1进行了功能验证。

在HSC细胞中，通过实时荧光定量PCR发现lnc-LFAR1在不同的肝细胞型以及肝纤维化的不同时期表达水平不同，说明其表达受细胞类型以及肝纤维化分期影响，且TGFβ诱发lnc-LFAR1表达上调。

图2：HSC肝纤维化过程中lnc-LFAR1过表达

为了探究lnc-LFAR1在肝纤维化中的作用，首先通过慢病毒介导lnc-LFAR1沉默，微阵列分析对照组以及实验组，GO注释发现沉默lnc-LFAR1影响胞外基质基因的表达，KEGG途经分析发现沉默lnc-LFAR1影响胞外基质受体互作途径。

之后在沉默的lnc-LFAR1细胞中加入TGFβ，检测肝纤维化相关基因的表达情况，发现沉默lnc-LFAR1后抑制了TGFβ诱发的肝纤维化基因表达上调。蛋白免疫印迹以及激光共聚焦检测验证了这一观点。

此外还构建了lnc-LFAR1过表达载体，发现在HSC细胞中肝纤维化相关基因表达上调并通过了蛋白免疫印迹验证了这一观点。这些观点共同说明lnc-LFAR1促进了促纤维化基因的表达并激活了HSC。

图3：在初级的HSC细胞中lnc-LFAR1调控胞外基质基因的表达

之后为了研究lnc-LFAR1在活体内对肝纤维化的影响，将慢病毒介导沉默的lnc-LFAR1注射到CCl4处理过的小鼠体内，GO注释发现沉默lnc-LFAR1影响胶原原纤维组织以及TGFβ受体信号途径。

同理，放大镜检测，荧光免疫检测以及免疫组织化学检测发现lnc-LFAR1下调改善肝纤维化，蛋白印迹实验对这一观点进行了进一步验证。

此外还发现lnc-LFAR1下调减轻了促纤维化基因，促炎症基因，促凋亡基因的表达，且抑制了TGFβ引发的上调现象。

图4：在活体内沉默lnc-LFAR1减弱了CCl4诱发的肝纤维化

为了探究TGFβ促进lnc-LFAR1表达是否通过其下游的转录因子Smad2/3介导，本研究首先分别将Smad2以及Smad3沉默，发现沉默Smad2以及Smad3后，lnc-LFAR1的表达水平下降。

为了继续探究Smad2/3是否和lnc-LFAR1结合，在lnc-LFAR1的启动子区设计了四对引物，用Smad2/3的抗体进行免疫共沉淀，发现在启动了区存在三个Smad2/3的结合位点，用双荧光素酶活性检测发现lnc-LFAR1的结合位点存在于上游1297-1274之间，且TGFβ加强了其结合。

图5：在HSC中，Smad2/3介导TGFβ诱发的lnc-LFAR1表达

为了进一步了解lnc-LFAR1在TGFβ中的调控作用，作者检测了pSmad2/3和Smad2/3在lnc-LFAR1过表达和沉默的HSC中的表达，在沉默的lnc-LFAR1 HSC中Smad2/3的表达下调，而在过表达的lnc-LFAR1 HSC中上调，且lnc-LFAR1沉默抑制了pSmad2/3水平。

激光共聚焦检测进一步验证了pSmad2/3在沉默的lnc-LFAR1中被抑制，且TGFβ诱发其从细胞质向细胞核转移。而且TGFβ增加了pSmad2/3和Smad2/3表达水平，沉默lnc-LFAR1抑制了TGFβ诱发的pSmad2/3和Smad2/3表达水平上调。

为了检测lnc-LFAR1促进pSmad2/3是否和总的Smad2/3有关，用SB431542处理在HSC中过表达的lnc-LFAR1，发现SB431542排除了lnc-LFAR1诱发Smad2/3磷酸化的推测。

然后通过沉默TGFβ途径的受体TGFβ R1，蛋白免疫印迹检测以及TGFβ R1作为抗体进行RNA免疫共沉淀发现lnc-LFAR1和TGFβ R1互作，最后作者进一步通过免疫共沉淀发现TGFβ R1 和Smad2/3在HSC中互作，说明lnc-LFAR1参与了TGFβ途径。

这些观点表明了lnc-LFAR1促进Smad2/3的表达，并促进了其在肝纤维化的细胞中发生磷酸化。

图6：在肝纤维化过程中lnc-LFAR1上调Smad2/3的表达并促进其磷酸化

除了TGFβ外，作者好奇lnc-LFAR1是否还通过其他途径调控肝纤维化，故检测了Wnt，Hippo，Notch，Hedgehog途径的靶基因或组分发现其在 lnc-LFAR1沉默的HSC细胞中下调，而在lnc-LFAR1过表达的HSC细胞中上调。

蛋白免疫印迹也验证了这一观点。且lnc-LFAR1沉默抑制了TGFβ和CCl4引发的表达上调。最后通过对Hes1和Notch3组织免疫学检测以及对Hes1和Notch3阳性区域进行进一步检测论证了这个观点。

这些观点表明 lnc-LFAR1促进了肝纤维化并通过激活Notch途径激活了HSC。

图7：在初级HSC中lnc-LFAR1通过激活Notch信号途径促进肝纤维化

为了进一步探究lnc-LFAR1在哪种分子机制下促进肝纤维化，用Smad2/3的抗体进行RNA免疫共沉淀，发现Smad2/3与lnc-LFAR1互作。

为了检测lnc-LFAR1是否通过绑定Smad2/3促进α- SMA，Collα1表达，在lnc-LFAR1过表达的HSC中分别加入沉默的Smad2以及Smad3，蛋白免疫印迹发现α- SMA的表达减少，说明它们互作后调控下游基因的表达。

免疫共沉淀发现在lnc-LFAR1过表达的HSC中，肝纤维化相关的靶基因表达上调，这些结果表明lnc-LFAR1和Smad2/3互作后作用于靶基因调控其表达。   

图8：lnc-LFAR1和Smad2/3互作调控靶基因表达

在医学研究中，从成千上万条基因中挑选候选基因无疑是大海捞针，但借助于越来越发达的科技手段可以有效帮助医学研究者客服这一难题。

如本文作者，从肝纤维化这一现象利用小鼠建立肝纤维化这一稳态模型，利用微阵列筛选在肝中丰富且差异表达的候选基因lnc-LFAR1，猜想其与肝纤维化相关，并随后分别在肝纤维化相关细胞HSC以及活体内分别利用生物信息学手段做了功能预测及进行了实验验证，并在预测及验证的过程中发现TGFβ可以显著增加lnc-LFAR1表达上调。

作者因此又探究了lnc-LFAR1如何受TGFβ调控以及在此途径中的作用，后来思维拓展猜想是否还受其他途径影响并进行了进一步验证，确定了候选基因lnc-LFAR1影响TGFβ和Notch途径后，作者进一步探究了lnc-LFAR1影响这些途径的方式并进行了验证。

由此，其他医学研究者可以在此思路上研究miRNA或者ceRNA对肝纤维化的影响，以相同的方法在小鼠中建立肝纤维化的稳态模型，利用芯片技术筛选差异表达的miRNA或者ceRNA，然后进行实验验证。

或者在已明确某一miRNA影响肝纤维化的情况下，慢病毒介导miRNA沉默，再利用芯片技术筛选沉默组与对照组的差异基因，最后GO注释以及KEGG预测差异基因的功能及影响途径，最后进行实验验证。这两种研究方法是比较快速的且一般研究室（资金，设备）基本有能力完成。

通过多次运用生信手段分析，为下一步研究提供了明确的研究方向，为实验前期节约了大量时间及资金浪费，后期再通过实验验证，让研究结果更有说服力。