零实验揭示类风湿性关节炎（RA）lncRNA功能

目前关于mRNA和miRNA的研究数不胜数，继而逐渐发现长链非编码RNA（lncRNA）在各种生物过程中也起着重要的作用，lncRNA成功吸引到科研大佬们的关注，但目前lncRNA功能注释的研究甚少，怎样分析lncRNA的功能呢？

今天就借助Jiang等2017年的一篇文献[1]和大家分享一种lncRNA的研究套路——通过构建lncRNA-miRNA-mRNA网络来揭示lncRNA的功能，零实验、纯生信分析哦。

划重点：零实验！

依据ceRNA理论，研究lncRNA与miRNA和mRNA在功能上的联系，来揭示类风湿性关节炎（RA）中lncRNA功能。

首先，我们来看研究思路

lncRNA–miRNA–mRNA network构建流程图

是不是很简单~

接下来就详解怎样完成这四步咯

（1）初始数据集

miRNA数据：①从GEO数据库挑选两组数据：GSE71601、GSE37425，筛选出22个共表达miRNA（共表达miRNA：有相同的子序列、且表达趋势一致的miRNA）；②miRNA-17, miRNA-20, miRNA-124和miRNA-152，这四个已知对RA具有重要调控作用的miRNA也被纳入后续分析。

lncRNA和miRNA数据：引用Jiang等2016年文献中[2]，关节炎小鼠滑膜组织中差异表达的260lncRNAs和675 mRNAs。

（2）差异表达分析

对初选出来的lncRNA、miRNA和mRNA进一步筛选，t-test，设定P-values<0.05, fold change>2，筛选得到差异表达miRNA(DEMis)、mRNA(DEMs)和lncRNA(DELs) 的数量分别为24、242和68。

（3）基于miRNA预测靶向lncRNA和mRNA

以24个DEMis为中心预测靶向lncRNA和mRNA

7个靶向lncRNA：用RNAhybrid program对miRNA–lncRNA进行预测，方法细节见下图

90个靶向mRNA：miranda和 targetscan数据库下载miRNA–mRNA互作关系

（4）构建lncRNA-miRNA-mRNA网络，功能富集分析

基于ceRNA理论，构建lncRNA–miRNA–mRNAnetwork，方法如下：

①共表达lncRNA–mRNA pair：DELs和DEMs表达相关性分析：PCC > 0.99, P < 0.05；

②lncRNA-miRNA–mRNAtriplet：lncRNA–mRNA pair中lncRNA和mRNA都是某一miRNA的靶向基因，且与该miRNA呈表达负相关，符合该条件的构建为miRNA–mRNA–lncRNAtriplet。

③Cytoscape软件将所有miRNA–mRNA–lncRNA triplet网络联系并可视化，计算节点度。

这样就成功构建lncRNA-miRNA-mRNA网络。

功能富集分析：利用Cytoscape plug-in BinGO and Database，对网络中的mRNA进行GO功能分析和pathway分析；得到147条生物过程相关GO terms及互作关系（下图）。

设定：P-value<0.05和Benjamini   P-value<0.05，筛选出84条显著富集的GOterms和23条pathway，前10条GO terms和pathway分别如图A和图B所示。

（5）关键lncRNA及功能

为了找出关键lncRNA，进行如下筛选过程：

①枢纽节点：计算lncRNA–miRNA–mRNA网络中所有节点的节点度，筛选出30个枢纽节点（节点度≥5），包含7lncRNAs, 13miRNAs和10mRNAs（见下表）

②关键lncRNA:计算lncRNA有关的miRNA和mRNA数量，结果如下表所示。排列靠前的3个lncRNA：S5645.1, XR_006437.1, J01878，具有较高的节点度、及miRNA和mRNA数量，可以作为关键lncRNA。

③关键lncRNA的功能分析：Cytoscape提取关键lncRNA相关的miRNA和mRNA构建亚网络结构，并进行功能富集分析，下图是3个关键lncRNA的亚网络及功能分析结果。

lncRNA S5645.1

lncRNA XR_006437.1

lncRNA J01878

最后根据这些lncRNA的功能富集预测其功能，例如lncRNAS5645.1的GO和pathway分析结果显示与RA高度相关，推测：s5645.1 lncRNA可能与一些miRNA家族存在竞争作用，如miR-152和miR-20家族，影响RA疾病相关的下游基因表达。

思维延伸：一篇没有任何实验的文章（IF=2.781）就这样发出来了。该文章在原始数据选用上还是存在较大缺陷的，同一类型数据来源物种不一致——miRNA数据来源于不同物种（人和小鼠），动物模型数据分析人类疾病——lncRNA和mRNA数据也是来自小鼠，这些数据引用合理性存在较大异议，故我们在挖掘数据时应合理筛选数据，如数据类型、物种来源、组织来源、样本量大小等，准确筛选原始数据是生信分析的基础。

但文章的研究套路还是可以借鉴哒——通过构建lncRNA-miRNA-mRNA网络来揭示lncRNA，从不同方向拓展继续挖掘数据发文章，如：分析其他疾病的的lncRNA功能，在不同数据库（TCGA）挖掘数据，starBase、CRN、Firebrowse等也可用于lncRNA-miRNA-mRNA网络构建等。也就是已知故事框架，不同方式补充不同内容就可以讲不同故事！

希望能帮助到大家更好地利用生信资源，少做实验多发文章！！！

1.Jiang, H., et al., Reconstruction and analysis of thelncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functionallncRNAs in rheumatoid arthritis. Molecular Biosystems, 2017. 13(6).

2.Jiang, H., et al., LncRNAs expression in adjuvant-inducedarthritis rats reveals the potential role of LncRNAs contributing to rheumatoidarthritis pathogenesis. Gene, 2016. 593(1):p. 131-42.