在卵巢癌中WNT7A受miR-15b调控

这篇文章中，作者报道了WNT7A在OvCa中大量存在，并在转录后受下调。还验证了miR-15b在癌症中的抑制作用，在OvCa患者中WNT7A表达高，miR-15b表达低的实验组中总体存活率差。

此外，作者的结果还表明DNMT1通过对启动子进行甲基化来调节miR-15b反转录能力[3]。

本文最突出的一点是在实验之前只知道WNT7A在卵巢癌细胞中上调，却最终探索到引发WNT7A上调的源因素，其中最大的功臣当然是各种生物信息学工具喽。

如使用TargetScan, PicTar 和 miRanda等靶标预测软件对与WNT7A结合的miRNA进行预测以及使用TCGA数据库评估患者生存率验证其关联（不会用的可以找我们哦~），随后再用各种常见的实验手段去证实在OvCa中WNT7A受miR-15b调控。

这篇文章的逻辑思路灰常简单

保证让你一看就懂一学就会~

接下来要唠唠常见的方法啦~

1.生物信息学预测在卵巢癌中WNT7A是miR-15b的重要靶标

首先在侵袭性的或者高浆液性的 OvCa细胞SKOV3.ip1,KURAMOCHI, OVCAR4和OVSAHO中检测WNT7A的表达水平，发现其表达丰富。

随后检测WNT7A启动子的反转录活性，然而并没有得到期望的结果。

故用3个不同的软件TargetScan, PicTar and miRanda分别预测与WNT7A的3’-UTR互作的miRNA匹配序列，分别为miR-15a, miR-15b和miR-195。

2.用TCGA-OV datasets计算患者生存率验证WNT7A和miR-15b关联

使用TCGA数据库评估WNT7A 和 miR-15b表达的预后影响，发现和miR-15b低表达相比，miR-15b高表达预后较好，WNT7A没有显示出任何关联。

WNT7A高表达和miR-15b低表达和减少卵巢癌病人的生存率有关。

故对miR-15b进行进一步研究。除此之外，还发现BCL2 和miR-15b之间负相关。

关于卵巢癌病人的生存率BCL2 和miR-15b之间并无明显联系。说明在卵巢癌中WNT7A是miR-15b的重要靶标。

3.荧光素酶活性报告检测验证WNT7A 3’-UTR和miR-15b在SKOV3.ip1 和OVSAHO细胞中互作

为了检测miR-15b是否绑定到WNT7A的3’-UTR，将含WNT7A 3’-UTR的pMIR-REPORT质粒转染到OvCa细胞，随后进行荧光素酶报告活性检测，和负对照相比，荧光素酶活性明显被miR-15b抑制。

已知WNT7A激活CTNNB1信号途径，为了检测miR-15b 抑制 WNT7A活性，用TOPFLASH检测CTNNB1介导的反转录活性，发现miR-15b显著抑制TOPFLASH报告活性，当TOPFLASH活性在ES2细胞中被WNT7A或者 S33Y-突变型 CTNNB1增加，低水平的或无法检测的内源性的WNT7A, miR-15b能抑制WNT7A引起的TOPFLASH活性增加，而不是那些S33Y引起的。

4.qPCR检测在OvCa中WNT7A的表达水平再次验证其直接受miR-15b调控

qPCR检测发现在 OvCa 细胞中，miR-15b剂量依赖性降低WNT7A mRNA 水平。

这些结果表明在OvCa中WNT7A的表达水平直接受miR-15b调控，BMI1和 BCL2已被报道受miR-15b调控，也检测了BMI1 and BCL2在OvCa细胞中的mRNA水平。

然而，在OvCa 细胞中并不能说明BCL2, BMI1减少受miR-15b调控。

5.细胞增殖实验和粘附实验证实在OvCa细胞中miR-15b是一个肿瘤抑制子

以前的研究认为miR-15b是一个肿瘤抑制子，在这项研究中，miR-15b在OvCa细胞中过表达，并随着时间延长低增殖，并诱发细胞粘附，表明在OvCa细胞中miR-15b是一个肿瘤抑制子。

6.DNMTs（甲基转移酶）的抑制子5-aza-2’dC处理细胞，检测miR-15b和WNT7A在OvCa 细胞中的表达水平，qPCR检测DNMT同系物的表达水平找出影响启动子甲基化的DNMT

miR-15b低表达诱发WNT7A高表达，为了检测miR-15b在OvCa细胞中低表达可能是由于启动子甲基化。用DNMTs（甲基转移酶）的抑制子5-aza-2’dC处理细胞，在OvCa 细胞中剂量依赖性增加了miR-15b的表达和减少了WNT7A的表达。

作者用5-aza-2’dC (5 μM)处理的 OvCa 细胞，检测三个活化的DNMT同系物DNMT1，DNMT3A和 DNMT3B的表达水平，发现只有SKOV3.ip1 和 OVCAR4细胞中DNMT1表达水平降低，表明DNMT1对甲基化miR-15b起作用。

7.沉默DNMT1后再次检测miR-15b的表达水平验证其关联

沉默DNMT1明显增加了miR-15b的表达，表明miR-15b具有潜在的抑制特性，特别是在WNT7A高表达的细胞中，通过DNMT1对启动子进行甲基化。

在本研究中作者认为miR-15b在OvCa细胞中低表达可能是由于启动子甲基化引起的。引起miRNA低表达的因素有哪些？本研究中引起miR-15b低表达会不会还有其他的因素？

1.King, M.L., et al., WNT7A/beta-catenin signaling induces FGF1and influences sensitivity to niclosamide in ovarian cancer. Oncogene,2015. 34(26): p. 3452-62.

2.Yoshioka,S., et al., WNT7A regulates tumor growthand progression in ovarian cancer through the WNT/beta-catenin pathway. MolCancer Res, 2012. 10(3): p. 469-82.

3.MacLean,J.A., 2nd, et al., WNT7A Regulation bymiR-15b in Ovarian Cancer. 2016. 11(5):p. e0156109.