初识蛋白质组的老师们看过来！硬核干货~

转自凌恩生物

蛋白质组学指的是在不断变化的生物条件下定量测量蛋白质组的表达。
液相色谱与结合串联质谱(LC-MS/MS)的蛋白质组学技术，在硬件和软件的快速发展的推动下，已将蛋白质组学转变为能够在一天内测量数百个样本的高通量实验过程。
但是还是有很多老师不太懂如何选择这些技术，我师妹就遇到了这类问题：
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下面就由大师姐给我们介绍一下这几个技术和优缺点吧~

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Label-free技术

      Label-free，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做同位素特定标记处理，该技术通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析，分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，对被检测到的离子峰强度进行积分，以积分面积进行相对定量。
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技术优势：

无需标记，最大程度的保留样本的真实性；

可以区分“有”“无”蛋白；

不受标签数量的限制，多个样本可以同时进行蛋白定量分析；

不同物种和不同的样本类型可以同时开展蛋白定量分析；

处理步骤简单，成本低；

样本数量比较少，10个以内比较推荐。

缺点：

单样本上机，定量稳定性和重复性不高。

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2

iTRAQ/TMT技术

      iTRAQ/TMT均为体外标记技术，采用N(4/8/10/18)种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较N个不同样品中蛋白质的相对含量。

一级谱图中，不同样本的同一段，标记后为相同质荷比。二级谱图中，平衡基团中性丢失，带不同同位素标签的同一肽段产生不同的报告离子，根据报告离子丰度获得样本间相同肽段的定量信息。

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备注：

Reporter：报告离子基团，用来对不同肽段进行定量；

Balance：平衡基团，保证同一肽段标记后母离子质量一致；

Peptide Reactive Group：肽反应基团，与氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基反应连接。

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技术优势：

定量稳定性好，重复性好!

适用于同一物种同一组织共有蛋白差异比较；

分离能力强，可分离出酸/碱性蛋白，小于10KDa或大于200KDa的蛋白、难溶性蛋白等；

蛋白鉴定数量多；

多样本上机，样本量34个以内。

劣势：

不可比较有无蛋白。

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3

4D-DIA技术

4D蛋白质组学技术是一种新兴的技术，基于timsTOF Pro2质谱仪，在传统三维数据（保留时间、质荷比、离子强度）的基础上增加了第四个维度，离子淌度的信息，离子淌度概念的引入使得蛋白质组学进入4D新时代。


技术优势：

1) 扫描速度快：尤其适用于临床大队列样本分析，超过34个样本推荐。

2) 高准确性：离子淌度提高了数据完整性，更低的错误发现率；

3) 高灵敏度：高扫描速度获得更高的灵敏度，鉴定到更低丰度的蛋白；

4) 高稳定性：可以连续分析数千个样品，仪器保持稳定的性能。

单样本上机，样本量18个以上。

劣势：

需要DDA建库，成本高。

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下面3个表格是最重要的总结哦，其中还包括常见样本送样信息，请大家收好~
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还有2个常见问题想与大家分享：

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标记定量iTRAQ/TMT和非标记定量DIA如何选择呢？


两相比较之下，非标记定量DIA更适用于以下情况：
1）实验组数高于10组；
2）样本来源于不同物种、不同组织或不同部位，需进行平行蛋白组定量检测；
4）需要区分样本中的“有无蛋白”；
5）追求更精准的定性和定量效果，避免标记和液相分组引入的实验误差；
6）需要对采集的数据进行多次重挖掘分析。
两相比较之下，标记定量iTRAQ更适用于以下情况：
1）实验组数低于10组（即同时比较的样本数≤10）；
2）样本背景较为相似（相同物种和相同的样本类型）。

这么看来，如果您的样本量＞10，想不受限制地获得更为丰富和精准的数据，DIA将是更合适的选择。

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DIA蛋白组在做血浆血清样本时是否需要去高丰度呢？


去高丰度可以一定程度上提升鉴定数量，但确实增加了操作步骤，一般情况下，DIA可以不去高丰度也可以达到不错的鉴定效果，但是如果追求鉴定更多的蛋白，那就可以去高丰度。

项目经验就是参考，一般情况下，多数项目在不去高丰度的情况下，采用uniprot搜库还是能达到1000左右，是不是能满足老师的检测需求？对于有蛋白鉴定数要求的客户，从1000提升到1200左右，也是提升了20%左右的鉴定值。

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